毕赤酵母表达重组人凝血酶原2及活性分析

目的：通过毕赤酵母（Pichia pastoris）表达制备重组人凝血酶原2（prothrombin-2）,并利用锯鳞蝰（Echis carinatus）凝血酶原激活剂ecarin将其活化为凝血酶,分析凝血酶的活性。方法根据GenBank公布的人凝血酶原2和ecarin的cDNA序列,设计并优化合成凝血酶原2和ecarin基因。将凝血酶原2基因构建至表达载体pPICZαA中,转化并筛选重组凝血酶原2的糖基工程酵母菌,诱导工程酵母分泌表达凝血酶原2,培养上清中的目的蛋白经两步阳离子层析纯化制备,并利用酶切N-糖链和肽指纹图谱分析鉴定目的蛋白。将ecarin基因构建到表达载体pcDNA3．1（＋）,瞬转HEK 293T细胞,收集培养上清。将HEK 293T工程细胞培养上清与纯化的凝血酶原2反应,利用凝血酶发色底物S-2238,测反应产物的酶促活性;利用血浆纤维蛋白原测反应产物的血凝时间、分析血凝活性。结果酵母表达凝血酶原2的培养上清经纯化获得37×103的目的蛋白,去除N-糖链的蛋白相对分子质量降为35×103,与凝血酶原2理论分子量一致。经肽指纹图谱鉴定,纯化得到的蛋白为凝血酶原2。制备的凝血酶原2经HEK 293T细胞表达ecarin的培养上清处理后,可催化S-2238解离产生黄色的对硝基苯胺（pNA）,且pNA产生的光密度值随着处理的凝血酶原2的增加而升高;经ecarin处理的凝血酶原2能促进血浆凝结,与凝血酶试剂的血凝时间接近,且血凝时间随着处理的凝血酶原2的量减少而延长。结论利用毕赤酵母制备了重组人凝血酶原2,被ecarin活化为具有活性的凝血酶,有望替代从血浆中提取的凝血酶原,用于战伤救治和临床研究。     

长效人白细胞介素4拮抗剂的研究

目的：研制保留白细胞介素4受体（IL-4R）结合能力,但不具有激活下游信号活性的人白细胞介素4（IL-4）突变体M5,并通过抗体Fc融合延长其体内半衰期,为变态反应病药物研发提供基础。方法全基因合成人IL-4突变体M5,将其克隆到pBV220表达载体,在大肠杆菌DH5α中表达M5蛋白。同时构建嵌合基因M5-IgG1 Fc,并克隆到pPICZαA载体中,电转化糖基工程毕赤酵母GJK01,经甲醇诱导,分泌表达M5-IgG1 Fc融合蛋白。利用CTLL-2／IL-4R细胞测定纯化所得M5蛋白、M5-IgG1 Fc融合蛋白的IL-4拮抗活性,最后利用ELISA试剂盒检测比较两者在小鼠体内的清除速度。结果由大肠杆菌DH5α表达的M5蛋白和糖基工程酵母GJK01表达的M5-IgG1 Fc融合蛋白都具有IL-4拮抗活性,它们在CTLL-2／IL-4R细胞上拮抗IL-4（5．6×10-2 nmol／ml）的EC50分别为（0．31±0．05）和（0．77±0．03）nmol／ml。小鼠体内M5蛋白在注射后0．5 h时达峰,其在血液中的含量为5．8×10－2 nmol／ml,而在2 h时血药浓度已下降为峰值的2．8％,在8 h时低于ELISA试剂盒的检测限。 M5-IgG1 Fc融合蛋白在注射后0．5 h时血液中浓度也达到峰值,为4．7×10－2 nmol／ml,120 h时其血药浓度下降为峰值的4．3％,而168 h时低于ELISA试剂盒的检测限。结论 M5蛋白具有IL-4拮抗作用。由糖基工程酵母表达的M5-IgG1 Fc融合蛋白不仅具有IL-4拮抗活性,而且在小鼠体内具有较长的半衰期,为下一步将其研发为治疗变态反应病的药物提供了理论基础。     

重组人干细胞因子理化性质和生物活性分析

干细胞因子（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ,ＳＣＦ）是一种对造血细胞有重要作用的因子,在自体外周血造血前体细胞移植、肿瘤放化疗的辅助治疗、贫血和其他血液病的治疗方面有良好的应用前景。目的：分析所制备的ｒｈＳＣＦ的理化性质和生物活性。方法：用反相高效液相色谱、质谱、凝胶高效液相色谱等方法分别测定了制品的纯度、分子量、氨基酸组成,紫外光谱等,并用ＴＦ－１细胞测定了液相色谱等方法分别测定了制品的纯度、     

白细胞介素-1β具有流感疫苗鼻黏膜免疫佐剂作用

目的 研究IL-1β是否能作为流感疫苗鼻黏膜免疫的佐剂.方法 采用鼻腔给药免疫Balb/c小鼠,每只小鼠免疫0.3 μg HA的流感疫苗与1、0.25、0.06或0 μg的rhIL-1β的混合物25μg.分别于免疫后0、2、3、4周用ELISA检测血清中流感特异性IgG,小鼠剖杀后检测肺黏膜和肠中特异性IgA.结果 小鼠血清中流感疫苗特异性IgG的滴度随rhIL-1β浓度增加和免疫时间的延长而明显增加;rhIL-1β还能促进黏膜产生IgA,肺黏膜IgA水平在rhIL-1β剂量为0.25μg只时最高,而肠黏膜IgA在rhIL-1β剂量为0.06μg只时最高.结论 rhIL-1β与流感疫苗合用滴鼻免疫,可有效刺激小鼠产生特异性的抗流感IgG和IgA,且其佐剂作用与其剂量呈相关性.IL-1可能是一种有效的流感疫苗鼻黏膜免疫佐剂.     

自细胞介素-1β具有流感疫苗鼻黏膜免疫佐剂作用

目的研究IL-1β是否能作为流感疫苗鼻黏膜免疫的佐剂。方法采用鼻腔给药免疫Balb／c小鼠，每只小鼠免疫0．3μg HA的流感疫苗与1、0．25、0．06或0μg的rhIL-1β的混合物25μL。分别于免疫后0、2、3、4周用ELISA检测血清中流感特异性IgG，小鼠剖杀后检测肺黏膜和肠中特异性IgA。结果小鼠血清中流感疫苗特异性IgG的滴度随rhIL-1β浓度增加和免疫时间的延长而明显增加；rhIL-1β还能促进黏膜产生IgA，肺黏膜IgA水平在rhIL-1β剂量为0．25μg/只时最高，而肠黏膜IgA在rhIL-1β剂量为0．06μg/只时最高。结论rhIL-1β与流感疫苗合用滴鼻免疫，可有效刺激小鼠产生特异性的抗流感IgG和IgA，且其佐剂作用与其剂量呈相关性。IL-1可能是一种有效的流感疫苗鼻黏膜免疫佐剂。     

Endo-H在毕赤酵母中的表达、纯化及其在N-糖基化分析中的应用

目的：通过巴斯德毕赤酵母（ Pichia pastoris）表达制备内切β-N-乙酰氨基葡糖苷酶-H（ endo-beta-N-acetyl-glucosaminidase H ,Endo-H）,并用于蛋白质的N-糖基化分析。方法根据GenBank中公布的褶皱链霉菌（ Strepto-myces plicatus） Endo-H的cDNA序列,设计并合成Endo-H全基因,将其克隆至P．pastoris表达载体pPIC9中,重组质粒转化P．pastoris JC308宿主菌,工程菌经甲醇诱导,分泌表达Endo-H,目的蛋白经疏水层析、凝胶过滤两步纯化后,纯度可＞95％。成品用于基于DNA测序的荧光辅助糖电泳（ DNA sequencer assisted fluorophore-assisted carbohy-drate electrophoresis,DSA-FACE）分析核糖核酸酶B（ribonuclease B,RNaseB）的糖基结构,比较了Endo-H与商品化N-糖酰胺酶F（peptide-N-asparigine amidase F,PNGase F）的糖基切割功能。结果利用P．pastoris表达制备Endo-H,可切割天然或变性状态下的β-1,4-糖苷键连接的甘露糖型结构糖链,不能切割复杂型糖链糖蛋白;经DSA-FACE分析,结果显示Endo-H酶切RNaseB后其糖链为Man5 GlcNAc-Man9 GlcNAc,PNGaseF酶切RNaseB的糖链为Man5 GlcNAc2-Man9 GlcNAc2,两者相差一个GlcNAc。结论通过P．pastoris制备的Endo-H具有天然生物活性,可用于蛋白质的N-糖基化结构分析。     

甘露糖化hLYZ/eGFP融合蛋白的表达纯化及巨噬细胞定位

目的利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶（human lysozyme,hLYZ）;进而利用巨噬细胞（macrophage,MR）表面的甘露糖受体（mannose receptor,MR）将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础。方法为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,eGFP）,观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化。毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体（macrophage mannose receptor,MMR）的竞争性配体甘露聚糖（mannan）的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞。结果毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量（Mr）为（66～97）×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F（PNGaseF）酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致。该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生。结论毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞。     

7TD1细胞及其克隆对IL—6的反应性和依赖性

比较了本院基因医学研究所和北京医科大学提供的两株７ＴＤ１细胞。选择北京医科大学提供的细胞株进行克隆，筛选出对ＩＬ－６增殖反应性和依赖性较强的３株细胞（７ＴＤ１ＭＣ１、７ＴＤ１ＭＣ４、７ＴＤ１ＭＣ５）。其中７ＴＤ１ＭＣ５细胞的反应曲线呈典型的“倒Ｓ”形，对ＩＬ－６的反应性和依赖性很好。ＭＴＴ比色法显示了与Ｔ３Ｈ－ＴｄＲ掺入法一致的结果，采用了７ＴＤ１ＭＣ５细胞及ＭＴＴ比色法测定ＩＬ－６生物活性，可减     

hIL-1Ra基因的克隆及在原核细胞中的表达

目的 :克隆hIL 1Ra基因并在大肠杆菌中高效表达。方法 :从人外周血中分离白细胞并提取其总RNA。用RT PCR获得hIL 1RacDNA ,克隆入pBV2 2 0表达载体进行诱导表达。对表达产物进行复性和纯化。结果 :成功地构建了pBV2 2 0 IL 1Ra表达载体 ,并在大肠杆菌中获得高效表达 ,表达量占全菌的 4 0 %。对表达产物进行分离纯化及活性分析表明 ,获得纯度大于98%的样品。该样品具有明显抑制IL 1刺激EL 4细胞分泌IL 2的作用。结论 :在大肠杆菌中成功地表达有活性的hIL 1Ra基因 ,为进一步的开发利用奠定了实验基础。     

甘露糖化hLYZ/eGFP融合蛋白的表达纯化及巨噬细胞定位

目的利用毕赤酵母表达蛋白具有高甘露糖修饰的特性,在毕赤酵母中表达甘露糖化修饰的人溶菌酶(human lysozyme,hLYZ);进而利用巨噬细胞(macrophage,MR)表面的甘露糖受体(mannose receptor,MR)将甘露糖化的人溶菌酶内吞入胞,为研究可入巨噬细胞杀灭其胞内感染菌的人溶菌酶提供基础。方法为使人溶菌酶可以在酵母中产生N-甘露糖化修饰,在人溶菌酶的C端设计2个N-糖基化位点;通过在其C端融合增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP),观察人溶菌酶在巨噬细胞RAW264.7中的亚细胞定位;同时在其C端引入了His标签便于融合蛋白的纯化。毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP与RAW264.7共孵育,借助激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白能否进入RAW264.7;通过巨噬细胞甘露糖受体(macrophage mannose receptor,MMR)的竞争性配体甘露聚糖(mannan)的阻断实验,检测甘露糖化的人溶菌酶是否通过MMR介导内吞。结果毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白是相对分子质量(Mr)为(66～97)×103的弥散条带,肽N-糖苷酶F(PNGaseF)酶切后,该融合蛋白变为Mr均一的条带,与非糖基化hLYZ/eGFP融合蛋白的理论Mr一致。该融合蛋白与RAW264.7共孵育后,可见细胞质中存在eGFP的绿色荧光,而加入甘露聚糖可以抑制这一现象发生。结论毕赤酵母表达的hLYZ/eGFP融合蛋白为高甘露糖型糖基修饰蛋白,该蛋白可以通过MMR介导内吞进入巨噬细胞。