53BP1蛋白对P53转录调控活性的影响

目的：探索含有BRCT结构域的P53分子结合蛋白53BP1调控P53转录活性的机制。方法：通过PCR的方法获得缺失不同结构域的53BP1基因突变体53BP1△1，53BP1△2，53BP1△3与53BP1△4，并采用双荧光素酶报告基因系统分析了它们对P53蛋白转录活性的影响。结果与结论：野生型53BP1蛋白可以明显提高P53的转录活性，其C端的BRCT结构域与核定位信号的存在为必不可少，而N端与P202蛋白相互结合结构域的存在也可以促进P53的转录活性．提示53BP1蛋白不同功能结构域之间的协同作用是保证其行使正常生理功能的前提条件。     

存活素基因表达调控机制的研究

目的 :阐明凋亡抑制蛋白存活素 (survivin)的基因表达调控机制。方法 :采用PCR的方法从人HeLaS3细胞基因组DNA中扩增得到survivin基因上、下游侧翼序列 ,将它们分别克隆至报告基因表达载体中 ,依据报告基因的瞬时表达结果确定它们对survivin基因的表达调控作用 ,进而采用定向缺失的方法确定其核心启动子 ,并通过凝胶阻滞实验进行验证。结果与结论 :survivin基因起始密码子上游 2 6 8bp的序列是指导其在肿瘤细胞中周期性表达的最小核心启动子 (mini_promoter)。此外 ,体外培养的正常人外周血淋巴细胞经PHA_P与IL_2的刺激增殖的同时 ,survivin基因也得以表达 ,提示survivin基因的表达与细胞的增殖过程密切相关。     

TSA诱导MOLT-4细胞中p21WAF1/Cip-1表达的功能机制研究

为了研究去乙酰化酶抑制剂TSA诱导MOLT-4细胞周期阻滞和凋亡反应中p21^WAF1/Cip-1的表达及其功能，以组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理急性淋巴细胞白血病细胞系MOLT-4，流式细胞仪和细胞吖啶橙染色、瑞士染色检测细胞周期和凋亡，Western检测p21^WAF1/Cip-1。的表达。结果表明：组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA可有效的诱导MOLT-4细胞发生G2／M阻滞和凋亡，并且呈现明显的剂量效应关系和时间效应关系；在此周期阻滞与凋亡反应过程中，p21“…“‘川蛋白的表达水平在周期阻滞前快速增高，而在凋亡早期开始下降。p21^WAF1/Cip-1分子在细胞中的表达规律与TSA诱导的细胞G2／M阻滞和凋亡反应间存在明显的剂量效应关系和时间效应关系；蛋白酶体抑制剂MG—132提升p21^WAF1/Cip-1分子在细胞中的表达可以增进细胞的G2／M阻滞反应而延缓凋亡。结论：蛋白酶体途径参与TSA诱导的MOLT-4细胞周期阻滞向凋亡转换过程中p21^WAF1/Cip-1分子的降解调控；p21^WAF1/Cip-1在TSA诱导的MOLT4细胞G2／M阻滞和凋亡反应中起着重要调节作用。     

凋亡素选择性诱导肿瘤细胞凋亡及其分子机制

来源于鸡贫血病毒的凋亡素能够选择性地诱导肿瘤细胞凋亡,且不依赖于ｐ５３介导,对ｂｃｌ－２过表达不敏感的特点,使其成为一种非常有前景的抗肿瘤剂。该文介绍了凋亡素诱导细胞凋亡的作用特点,并对其凋亡选择性诱导研究的分子机制进行了探讨。     

凋亡素的克隆及诱导HeLa细胞凋亡

目的：克隆凋亡素（apoptin)的全长基因,在肿瘤细胞HeLa中表达并诱导其凋亡,方法：从CAV病毒基因组TK5803中通过PCR技术扩增凋亡素基因,直接克隆至真核表达载体pCDNA3.1/His/Topo,序列测定证实其正确性,并克隆至pCIneo真核表达载体构建重组表达载体,采用脂质体转染HeLa细胞,转染3d后Honchest33258染色并于荧光显微镜下观察细胞状态,结果与讨论：核酸序列分析证实所克隆的凋亡基因与文献报道的一致,将其成功克隆至真核表达载体,pCDNA3.1/his/Topo和pCIneo,构建了真重组质粒pCIneo-apoptin和pCDNA3.1/His/Topo-apoptin,转染Hela细胞3d后可见明显的细胞凋亡,而只转染空质粒的对照组则较少,表明凋亡素能够有效地诱导HeLa细胞凋亡,本研究为进一步研究凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制打下了基础。     

PKA磷酸化p21WAF后对其泛素化修饰和稳定性的影响

目的：探索p21被蛋白激酶A（PKA）磷酸化修饰后对其泛素化修饰和稳定性的影响。方法：构建p21可能磷酸化位点的突变体p21 T145A，观察PKA体外磷酸化修饰p21；Western印迹分析PKA特异性抑制剂H89对p21稳定性的影响；通过免疫沉淀分析H89对p21泛素化修饰的影响以及p21 Thr 145突变前后和Skp2结合能力的变化。结果：PKA体外磷酸化修饰p21的Thr 145；PKA特异性抑制剂H89能够提高p21的稳定性并抑制p21的泛素化修饰；野生型（wild）p21比p21 T145A结合sk02的能力强。结论：PKA磷酸化修饰p21的Thr 145后导致其结合E3连接酶结合亚基skp2的能力增强，从而促进p21的泛素化修饰，导致p21稳定性的降低。     

DNA错配修复基因MutS的克隆和表达

目的：克隆ＭｕｔＳ基因并构建高效表达菌株，为建立ＤＮＡ错配突变检测系统和应用于临床肿瘤的检测等打下重要的基础。方法与结果：通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组中扩增得到ＭｕｔＳ基因（２．６ｋｂ），克隆在ｐＧＥＭ－Ｔ载体上，构建了重组质粒载体ｐＧＥＭ－Ｔ／ＭｕｔＳ，核酸序列分析表明所克隆的基因与Ｇｅｎｂａｎｋ的ＭｕｔＳ一致。然后亚克隆到原核表达载体ｐＢＶ２２０上，构建了重组菌株ＤＨ５α／ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ，４２℃热诱导表达ＭｕｔＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在相对分子质量９７×１０３左右处出现一条表达量高达３０％以上的表达蛋白带，而对照菌株表达量很低。将重组质粒ｐＢＶ２２０－ＭｕｔＳ转化到ＭｕｔＳ缺陷菌株ＥＳ１３０１互补了该菌株ＭｕｔＳ的缺陷，使其链霉素、利福平抗性（Ｓｔｒｒ，Ｒｉｆｒ）的突变频率分别降低９９％、９６％。结论：克隆得到ＭｕｔＳ基因并在大肠杆菌中得到高效表达，表达的ＭｕｔＳ蛋白在菌体内具有生物学功能