EPL和PTS在生物合成主链环肽方面的应用研究进展

内含肽作为宿主蛋白的组成成分，不仅可将自身从宿主蛋白中剪切，而且还可催化外显肽的连接。内含肽广泛分布于生物界的三大领域及病毒蛋白中。蛋白质剪接是由内含肽介导的一种翻译后自催化加工过程，整个过程不需要酶或辅因子的参与。蛋白质剪接包括四步分子内的反应及内含肽和外显肽中部分发挥关键催化功能的氨基酸残基。表达蛋白质连接（ EPL）和蛋白质反式剪接（ PTS）技术是借助内含肽及蛋白质剪接发展起来的。该文主要就这两项技术在生物合成主链环肽文库方面的应用领域及未来的应用前景进行了综述。     

大鼠肝再生启动阶段肝细胞CCAAT增强子结合蛋白βmRNA、微小RNA-369-3p和rno-Rmdn2_0006的表达和作用

目的 了解大鼠肝再生启动阶段CCAAT增强子结合蛋白3(CEBPβ)mRNA、miR-369-3p和mo-Rmdn2_0006调节肝细胞处于G0期还是G1期的途径和方法.方法 按Higgins等方法制备大鼠2/3肝切除(PH)模型,按Smedsrod等方法分离肝细胞,用大规模定量分析技术检测大鼠肝再生中肝细胞竞争性内源RNA(ceRNA)表达的变化,用Cytoscape 3.2软件构建ceRNA的相互作用网络,用ceRNA综合分析等方法解析它们表达的相关性和作用相关性.结果 PH后0h和6h时,CEBP3 mRNA的比值为1.11±0.11和2.57±0.10,miR-136-3p为0.70±0.22和0.28±0.03,rno-Rmdn2_0006为1.26±0.34和2.62±0.70.CEBPp促进的G0期相关基因生长停滞和DNA损伤诱导型β(GADD45β)为0.12±0.09和2.50±0.44,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(CDKN1A)为0.39±0.07和0.93±0.15,抑制的G0期相关基因细胞周期蛋白依赖性激酶2相关蛋白2(CDK2AP2)为2.55±0.42和0.74±0.11,信号转导子和转录激活因子1(STAT1)为2.57±0.13和1.32±0.13.CEBPβ促进的G1期相关基因ETS变异转录因子6(ETV6)为0.77±0.05和2.22±0.68,血红蛋白加氧酶1(HMOX1)为1.05±0.21和4.57±0.88,丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)为1.01±0.15和2.01±0.32,硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)为1.03±0.07和2.50±0.19,抑制的G1期相关基因红细胞衍生核因子2样蛋白2(NFE2L2)为0.66±0.09和0.35±0.05.结论 PH后0h时,CEBPβ mRNA未上调,有利于CEBPβ抑制的G0期相关基因表达和肝细胞处于G0期.相反,PH后6h时,rno-Rmdn2_0006和miR-369-3p通过相互作用解除了后者对CEBPp mRNA的抑制,有利于CEBPp形成,有利于CEBPβ促进的G1期相关基因表达和肝细胞处于G1期.     

环式增强型绿色荧光蛋白热稳定性及Npu DnaE内含肽高反式剪接效率研究

目的在体内借助Npu DnaE内含肽(intein)的高效反式剪接作用获得环式增强型绿色荧光蛋白(Cyc-EGFP)。方法对构建的融合表达载体pET/Npu DnaE intein/EGFP-28a(+)进行诱导、表达,之后利用亲和纯化获得高纯度的Cyc-EGFP和增强型绿色荧光蛋白(EGFP),并对二者的荧光强度和热稳定性进行比较。结果 NpuDnaE内含肽环化效率可达98%以上,明显优于Ssp DnaE内含肽,环化后的EGFP热稳定性提高了4～5℃。结论 Cyc-EGFP这一明显优势使蛋白环化在蛋白质工程等领域具有重要的应用价值。     

应用Red重组技术构建四环素抗性多基因串联表达载体

目的构建一种四环素抗性的多基因串联表达载体。方法设计同源臂引物,通过重叠延伸PCR获取含四环素抗性基因的打靶序列,应用pKD46介导的Red重组系统,在DH5α内替换多基因串联表达载体pET-m28a（＋）中的抗性基因序列;再利用同尾酶（isocaudarner）策略,将sfp和accA1两基因串联组合于pET-mt28a（＋）中,并进行共表达鉴定。结果获得了含四环素抗性的重组质粒pET-mt28a（＋）;构建了两基因串联重组质粒pET/sfp/accA1-mt28a（＋）,且两基因能够在同一载体上协同表达。结论成功构建了一种四环素抗性表达载体pET-mt28a（＋）,并可介导多基因的协同表达,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础。     

人miR-139高效真核表达载体的构建及其功能初探

目的 构建人miR-139高效真核表达载体,初步探究miR-139在乳腺癌ZR75-1细胞中的功能.方法 设计成熟miR-139的PCR引物,扩增包含miR-139成熟序列的基因组序列.将扩增产物亚克隆到真核表达载体PIRES2-EGFP(IE)上,构建miR-139真核表达载体IE-139.将IE-139转染至乳腺癌ZR75-1细胞中,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-139的表达情况,同时检测过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc、EIF4G2和ZBTB34的mRNA水平.结果 酶切、测序结果表明,人miR-139真核表达载体构建成功;qRT-PCR表明,miR-139能在乳腺癌ZR75-1细胞中高效表达(P<0.01),过表达miR-139的乳腺癌ZR75-1细胞中c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),但ZBTB34的下降水平不明显.结论 成功构建了人miR-139真核表达载体IE-139,通过qRT-PCR检测,证明该载体能成功实现miR-139的高效过表达,并且miR-139能明显抑制乳腺癌ZR75-1细胞中癌基因c-Myc和EIF4G2的mRNA表达水平,这为进一步研究miR-139的功能及调控靶基因的分子机制奠定了基础.     

环式增强型绿色荧光蛋白热稳定性及Npu DnaE内含肽高反式剪接效率研究

目的在体内借助Npu DnaE内含肽（intein）的高效反式剪接作用获得环式增强型绿色荧光蛋白（Cyc-EGFP）。方法对构建的融合表达载体pET/Npu DnaE intein/EGFP-28a（＋）进行诱导、表达,之后利用亲和纯化获得高纯度的Cyc-EGFP和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,并对二者的荧光强度和热稳定性进行比较。结果 NpuDnaE内含肽环化效率可达98%以上,明显优于Ssp DnaE内含肽,环化后的EGFP热稳定性提高了4～5℃。结论 Cyc-EGFP这一明显优势使蛋白环化在蛋白质工程等领域具有重要的应用价值。     

大鼠肝再生的肝细胞周期启动及终止中骨髓瘤基因mRNA与其他非编码RNA的表达变化与作用

目的 了解大鼠肝再生(LR)0 h、6 h和72 h时骨髓瘤基因(MYC)及其mRNA相互作用的微小RNA(miRNA)和环状RNA(circRNA)调节肝细胞周期启动及终止的途径与方式。方法 按Higgins等方法制备大鼠2/3肝切除(PH)模型，按Smedsrod等方法分离肝细胞，用大规模定量检测技术测定大鼠肝再生中肝细胞的mRNA、miRNA和circRNA[合称内源竞争RNA(ceRNA)]表达变化，用Cytoscape 3.2软件构建ceRNA的相互作用网，用ceRNA综合分析等方法解析它们的表达相关性和作用相关性。结果 在PH后肝细胞周期启动0～6 h间的0 h和6 h时，MYC mRNA的比值为0.15±0.03和2.36±0.2,miR-134-5p为3.22±0.61和0.08±0.02,circRNA＿12112为0.68±0.21和13.35±3.53。同时，PH后0 h时，MYC促进的细胞周期启动相关基因Ras关联域家族成员1(RASSF1)、细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、超氧化物歧化酶2(SOD2)表达下调，抑制的细胞周期启动相关基因嵌套蛋白(NES)...