受控型蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ转基因载体的构建及其在细胞水平上的有效性检测

目的：构建一种可以在哺乳动物细胞中蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的受控型转基因载体，为制备受控型蜕皮激素诱导表达截短型MGF-Ⅰ的转基因小鼠奠定基础。方法：利用分子克隆技术构建受控型蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的转基因载体；将其电转至AM1菌中，利用其中的Cre重组酶将载体上两个同向LoxP序更锚定的新霉素（neomycin）基因删除，解除其对蜕皮激素诱导表达系统的阻断作用，利用PCR、酶切和测序鉴定删除情况；将重组后的载体转染至COS7细胞中进行瞬间表达，蜕皮激素诱导后回收培养上清和细胞裂解物进行Western印迹分析，检测hIGF-Ⅰ的表达情况。结果和结论：成功构建大小为13．6kb的转基因载体pOE-IGF-Ⅰ；转化至AM1中后，PCR、酶切和测序的结果都证明其中的Cre酶能够将载体上neomycin基因删除；重组后的载体转染至COS7细胞中进行诱导表达，Western印迹实验证明截短型MGF-Ⅰ能够在COS7细胞中顺利表达。上述结果证明该蜕皮激素诱导表达截短型hIGF-Ⅰ的受控型转基因载体能够用于转基因小鼠的制备。     

利用杆状病毒早期启动子在昆虫细胞中持续表达人β—干扰素

在含苜蓿尺蠖核多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）早期基因启动子的载体ｐＡｃＩＥ１中，插入人β－干扰素（ＨｕＩＦＮ－β）基因，构建成转移载体ｐＩＥ１－ＩＢ；ｐＩＥ１－ＩＢ与含新霉素抗性基因（ＮＥＯ＾ｒ）的质粒ｐＩＥ１－ＮＥＯ共转染秋粘虫细胞（Ｓｆ９细胞），使ＨｕＩＦＮ－β基因和ＮＥＯ＾ｒ基因整合到细胞基因组上产生转化细胞，含Ｇ４１８的培基分离新霉素抗性克隆，并增殖传代；转化细胞株传至５０代以上，不同传代水平细     

缺氧环境下4-DMAP形成高铁血红蛋白的药效学特征

目的研究高原缺氧环境下4-二甲基氨基苯酚（4-DMAP）形成高铁血红蛋白的药效学特征，为急进高原的氰化物中毒患者救治提供理论参考。方法急性缺氧家兔肌内注射4-DMAP，采集心血，通过比色方法测定高铁血红蛋白。结果急性缺氧对血红蛋白浓度和高铁血红蛋白本底无明显影响，但缺氧升高4-DMAP生成高铁血红蛋白的敏感性，缺氧环境下生成30％～40％高铁血红蛋白（最适抗氰浓度）所需4-DMAP的剂量为20mg／kg，相当于常氧环境所需剂量的68％～80％，当采用常氧环境的最适抗氰剂量（25～30mg／kg）时，缺氧家兔表现严重的缺氧病变，甚至死亡，而且在缺氧家兔体内，高铁血红蛋白维持时间明显延长；4-DMAP的效应还与动物缺氧时间密切相关，高铁血红蛋白生成浓度在1～5天内随缺氧时间增加而升高，5天达到高峰，7天开始回落，但仍然显著高于常氧对照组。结论缺氧提高4-DMAP生成高铁血红蛋白的能力，在缺氧动物体内，高铁血红蛋白代谢慢、维持时间长。     

重组人红细胞生成素单克隆抗体的制备

本文应用常规淋巴细胞杂交瘤技术制备了４株能稳定分泌抗人重组红细胞生成素（ｒＨｕＥＰＯ）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的小鼠杂交瘤细胞系ＢⅡ１Ｂ５、ＤⅡ６Ｂ９、ＭⅡ１Ｈ４和ＧＩ３Ｅ７。用鼠单克隆抗体分型试剂盒鉴定，其分泌的ＭｃＡｂ的类分别是ＩｇＭ、ＩｇＭ、ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ。间接ＥＬＩＳＡ法测定细胞上清的效价为１×１０－２～１．２５×１０－４，腹水效价为１×１０－２～１×１０－８。培养上清经ＥＬＩＳＡ鉴定，与ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－α等细胞因子均无交叉反应，只与ｒＨｕＥＰＯ特异性结合。     

t-PA突变体乳腺表达载体的构建及其在乳腺中的瞬时表达

目的 :探索建立乳腺瞬时性表达系统 ,用于快速检测所构建的乳腺表达载体的有效性 ,为进行转基因动物实验奠定基础。方法 :DNA常规操作 ;孕小鼠乳腺注射 ;纤维蛋白琼脂糖平板法检测Mut PA。结果 :构建了含有Mut PA基因的乳腺表达载体pB3mt PA ,将此载体直接注射到孕小鼠乳腺中进行暂时性表达 ,产仔后第 4天采乳汁 ,用纤维蛋白琼脂糖平板法检测t PA的活性 ,表达活性可达 2 0～ 4 0U/ml,其活性能被天然的t PA多克隆抗体所中和 ,表达持续期 8d。结论 :所克隆的牛BLG基因 70 5bp的 5′端调控序列包含了必需的调控元件 ,并具有调控外源基因的表达的功能 ,克隆的 3′端序列是适合的。构建的表达载体可用于制备转基因动物。     

提高转基因动物基因表达水平的途径

本文对转基因动物的研究特点以及近年来在转基因动物提高表达水平方面的研究做以综述。阐述了转基因的整合、MAR、共注射与同源重组、内台子以及RNA的剪接对转基因动物基因表达的影响。     

贺期在1500例临床麻醉中应用小结

贺斯 (HAES- ateril、6 %羟乙基淀粉 )为一种人工合成的血浆代用品 ,已在临床上推广使用。我院于1999年 5月至 1999年 12月底共在临床麻醉中应用150 0例 ,收到了较好效果。报告如下。1　临床资料本组共 150 0例 ,男 881例 ,女 6 19例 ,年龄 4～ 95岁 ,平均 36 .81岁。急诊 84 2例 ,择期 6 58例。应用范围 :普外手术 4 50例 (30 % ) ,妇产科手术 4 31例(2 8.7% ) ,骨科及四肢手术 311例 (2 0 .7% ) ,颅脑外科手术 16 2例 (10 .8% ) ,胸外科手术 (其中用于体外循环预充液 13例 ) ,146例 (9.7% )。贺斯用量及用法 ,输注贺斯 50 0～ 2 0 0 0 m…     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析

目的：克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析。方法：以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据，设计并合成D123／D61和D81／D84两对引物，同时从猪肝中提取猪基因组DNA，并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针，对猪λ噬菌体文库进行筛选。经过4轮杂交和PCR交替筛选，从噬菌体文库中共获得4个基因片段，并对这4个片段进行测序、拼接。以绿色荧光蛋白作为报告基因，对猪血清白蛋白启动子在Hep(泛细胞中的表达进行研究。结果：共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35kb(GenBank登录号：AY663543)。将其与人的血清白蛋白基因相比对，发现基因的同源性为53.8％，其中编码区同源性为82．3％。荧光显微镜下可见EGFP在HepC2细胞中的表达。结论：获得猪血清白蛋白全基因。猪血清白蛋白基因启动子在HepC2有转录起始功能。此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础，另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料。