锚定多重PCR技术的建立及其在核酸相对分子质量标准制备中的应用

目的利用5＇端锚定引物及多重聚合酶链反应（PCR）技术建立高效、特异性扩增核酸片段的方法,并探讨其在核酸相对分子质量（Mr）标准（DNA标志物）制备中的应用。方法针对常用的pMD19-T载体（2692 bp）序列,利用命令行程序pd4marker.py,结合Primer3及多因素引物特异性评估软件MFEprimer,设计5＇端锚定的上游引物和7对扩增不同目的片段的下游引物;其次,以转化有pMD19-T载体的大肠杆菌DH5α菌液为模板,分别进行一至七重PCR扩增;并将扩增产物经2%琼脂糖凝胶分离及凝胶成像仪采集图像分析;最后,评估该方法在核酸Mr标准制备中的应用。结果制备了特异性较好的一至七重PCR扩增产物,可针对不同实验目的进行不同核酸Mr标准的制备。结论建立了一种快速、特异性扩增核酸片段的锚定多重PCR方法,可根据不同实验目的,快速制备出不同Mr标准大小的核酸片段,进一步拓展了PCR技术的应用范围。     

利用GSP逆转录结合巢式PCR技术鉴定剪接变体的新方法及其在小鼠TrkC基因变体发现中的应用

目的利用基因特异性iI物（genespecificprimer,GSP）逆转录结合巢式PCR（nPCR）技术,建立鉴定剪接变体的新方法。方法以小鼠TrkC基因为例,参考其已知变体1和变体2的序列分别设计GSP和nPCR引物,以逆转录产物为模板进行nPCR反应,扩增产物采用1．5％琼脂糖凝胶分离并回收具有递减趋势的DNA片段,利用T／A克隆技术亚克隆到载体pMDl9一T进行直接测序,并与小鼠RefSeq数据库进行比对。结果利用GSP逆转录结合nPCR技术不仅可鉴定出mc基因的已知剪接变体,而且还能够筛选到TrkC基因的新剪接变体并命名为变体3,与变体1相比属于盒式外显子剪接模式,缺失了变体1的520～2188位共1669bp。结论利用GSP结合nPCR技术建立了一种鉴定剪接变体的方法,为新剪接变体的挖掘与功能研究以及理解异常剪接相关疾病的机制研究提供了重要参考。