人骨髓间充质干细胞分离培养及血管内皮生长因子对其产生的诱导分化作用

目的：目前有关骨髓间充质干细胞向内皮细胞诱导分化的研究较少。本实验分离和培养人骨髓间充质干细胞，用带有VEGF165的质粒转染人骨髓间充质干细胞，探讨血管内皮生长因子对其体外诱导分化的作用。 方法：实验于2005—04／2006—04在吉林大学人兽共患病教育部重点实验室完成。取成人的已排除血液系统肿瘤疾病的新鲜骨髓（自愿提供），采用Percoll梯度分离培养骨髓间充质干细胞，于倒置显微镜下观察细胞形态变化和生长情况。原代细胞培养至增殖接近融合状态时，单克隆培养法分离传代培养，扩增骨髓间充质干细胞。采用流式细胞术检测细胞免疫学表型。在原核细胞大肠杆菌DH5α中复制扩增和提取，纯化、克隆pcDNA3．0-VEGF165质粒。用脂质体转染法转染骨髓间充质干细胞：应用流式细胞术检测诱导后骨髓间充质干细胞免疫学表型变化j并采用免疫荧光染色鉴定转染情况，并设质粒空载和未转染的骨髓间充质干细胞为对照。 结果：人骨髓间充质干细胞原代培养1周后，造血细胞消失，贴壁细胞体积增大，呈现梭形外观，有粗大的细胞突起伸出。2周后细胞融合成单层，梭形突起变长，排列有明显的方向性，细胞排列成旋涡状、网状、辐射状。流式细胞术显示，人骨髓间充质干细胞免疫学表型CD44、CD29阳性，CD34、CD31、CD45阴性。VEGF165诱导骨髓间充质千细胞后CD44表达明显降低，CD31明显升高。免疫荧光染色显示，用FITC标记后的VEGF抗体使细胞显现绿色荧光，用cy3标记的CD31抗体使细胞显现了红色荧光。 结论：转染后的骨髓间充质干细胞细胞表型发生明显转变，CD31表达率明显增高，呈现典型的内皮细胞的表型特征，这说明骨髓间充质干细胞具有向内皮细胞分化的潜能。     

Effects of taurine on proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells in vitro

BACKGROUND: Hepatic fibrosis, a common response to chronic liver injury, is characterized by increased production of extracellular matrix components, whose major part is produced by hepatic stellate cells (HSCs). Taurine is a sulfur containing beta-amino acid rich in human body, and our previous experiments showed that it can inhibit the deposition of the extracellular matrix in the damaged liver. This work was to investigate the effects of taurine on proliferation and apoptosis of HSC and its possible mechanism. METHODS.. Cell proliferation was detected by the thiazole blue (MTT) colorimetric assay. Cell apoptosis and cell cycle were assessed via flow cytometry. The morphology of apoptotic cells was observed by phase-contrast fluorescent micrography after orange acridine staining,     

N-甲基-D-天冬氨酸受体在缺氧缺血性脑损伤新生大鼠脑海马中的远期表达

目的:观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后,海马发育过程中N-甲基-D-天冬氨酸受体的远期表达变化。方法:实验于2006-03/06在解放军第三军医大学新桥医院中心实验室完成。选用新生7日龄SD大鼠72只,按随机数字表法分为缺氧缺血性脑损伤组和假手术组,每组36只。各组又分为生后15d(n=6)、22d(n=6)、29d(n=6)、36d(n=12)及43d(n=6)5个时相点。①参照Rice法通过结扎7日龄大鼠左侧颈总动脉,吸入氧气体积分数为0.08的氮氧混合气,制成缺氧缺血性脑损伤模型,出现自发或夹尾左旋则证明模型制作成功。假手术组仅切开颈部皮肤,暴露左侧颈总动脉。②应用免疫组织化学法检测缺氧缺血后不同时点两组大鼠脑海马CA1区N-甲基-D-天冬氨酸受体NR1亚单位的表达(n=6),测量平均灰度值,灰度值越低,蛋白表达越强;生后36d时相点大鼠(n=6)利用Morris水迷宫测定学习记忆能力;最后应用电镜观察生后36d大鼠海马突触结构。结果:72只大鼠,全部进入结果分析,无脱失。①生后22-43d缺氧缺血性脑损伤组大鼠(缺氧缺血后15-36d)脑海马CA1区NR1平均灰度值分别为167.69±6.48,174.57±4.81,179.30±5.92,176.50±5.93,均显著高于同日龄假手术组148.96±4.91,151.17±6.37,152.06±9.86,156.32±6.86(P均<0.01)。②Morris水迷宫实验中,缺氧缺血性脑损伤组大鼠逃避潜伏期显著长于假手术组(48.87±9.47)s,(11.97±2.20)s,(P<0.01);原平台象限游泳距离/总游泳距离的百分比显著低于假手术组(14.45±3.85)%,(62.20±8.74)%(P<0.01)。③生后36d(缺氧缺血后29d),透射电镜下缺氧缺血性脑损伤组大鼠患侧海马突触后膜致密物较假手术组明显减少。结论:新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后期存在海马N-甲基-D-天冬氨酸受体的表达下调,可能对大鼠远期空间学习记忆产生一定影响。     

聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对异种移植猪肝细胞凋亡的抑制作用

目的：观察聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子对猪肝细胞异种移植后移植肝细胞凋亡的抑制作用. 方法：实验于2004-03/2005-03在南通大学神经再生实验室完成,选用中国实验用小型猪（n=5）及SD大鼠（n=123）.①实验分组及方法：采用原位胶原酶循环灌注法分离猪肝细胞.D-氨基半乳糖腹腔内注射制作大鼠急性肝衰竭模型,按随机数字表法分成3组（n=41）,分别在单纯肝细胞移植组、胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组急性肝衰竭大鼠腹腔内移植震荡培养24 h的猪肝细胞悬液、Ⅰ型胶原凝胶固定培养24 h的猪肝细胞、Ⅰ型胶原凝胶包埋的聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子培养24 h的猪肝细胞.②实验评估：观察移植肝细胞的病理变化、培养和移植肝细胞的凋亡率、坏死率及活率. 结果：①各组移植肝细胞的活率及凋亡率：纳米胶原肝细胞移植组移植肝细胞的存活时间最长.肝细胞体外培养1 d后,3组肝细胞均存在不同程度的凋亡,以单纯肝细胞移植组凋亡率最高,纳米胶原肝细胞移植组最低.胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组的移植肝细胞凋亡率随着移植时间的延长呈缓慢上升趋势,但较单纯肝细胞移植组为低;移植后1,2 d,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组的移植肝细胞活率明显高于单纯肝细胞移植组（P＜0.05）;移植后3,5 d时,纳米胶原肝细胞移植组移植肝细胞凋亡率明显低于胶原肝细胞移植组（P＜0.05）,活率则明显高于胶原肝细胞移植组（P＜0.05）.②各组移植肝细胞的坏死率：移植后1 d,胶原肝细胞移植组移植肝细胞坏死率明显上升;移植后2 d,3组肝细胞坏死率均有不同程度的上升,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组明显高于单纯肝细胞移植组（P＜0.05）,胶原肝细胞移植组高于纳米胶原肝细胞移植组（P＜0.05）.移植后3 d,单纯肝细胞移植组肝细胞坏死率大幅度上升,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组无明显变化,但显著低于单纯肝细胞移植组（P＜0.05）,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组之间差异无显著性意义（P＞0.05）.移植后5 d,胶原肝细胞移植组、纳米胶原肝细胞移植组肝细胞坏死率进一步上升,纳米胶原肝细胞移植组显著低于胶原肝细胞移植组（P＜0.05）. 结论：聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子有抑制培养和移植肝细胞凋亡、提高移植肝细胞活率的作用,聚乳酸-O-羧甲基壳聚糖纳米粒子和Ⅰ型胶原结合可增强抗培养和移植肝细胞凋亡的能力,延长移植肝细胞的生存时间.     

成纤维细胞生长因子2的分子结构和生物学效应

目的:成纤维细胞生长因子2是一种多功能、作用广泛的细胞因子。就成纤维细胞生长因子2分子结构和生物学效应以及与骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的相关研究进行综述。资料来源:应用计算机检索PubMed数据库1990-01/2006-10有关成纤维细胞生长因子2的文章,检索词“FGF-2,molecular structure,biological effect,myocardial infarction and rat and marrows tem cell”,限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库、万方数据库1990-01/2006-10期间的相关文章,检索词“碱性成纤维细胞生长因子”,限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,选取符合研究要求的有关文章找全文。纳入标准:①有关成纤维细胞生长因子2分子结构、生物学特性的研究。②有关骨髓间充质干细胞移植治疗急性心肌梗死的研究。资料提炼:共收集到34篇有关成纤维细胞生长因子2分子结构和生物学效应的文章,67篇有关骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死的研究。选取其中31篇归纳总结。资料综合:①成纤维细胞生长因子2在人体内普遍存在,许多体外培养的细胞也自分泌成纤维细胞生长因子2。成纤维细胞生长因子2包括18000的低相对分子质量成纤维细胞生长因子2和高相对分子质量成纤维细胞生长因子2。成纤维细胞生长因子2翻译的起始密码子有两种:AUG和CUG。②成纤维细胞生长因子2有两种不同的受体,它们可与相应的受体结合发挥生物学功能。③在体外培养骨髓间充质干细胞的过程中,成纤维细胞生长因子2可促进其向心肌样细胞分化,在相对缺氧的环境下,提高心肌样细胞存活率。结论:成纤维细胞生长因子2作为一种多功能的细胞生长因子,在胚胎发育,创伤修复以及缺血、炎症、肿瘤等情况下,可作用于靶细胞上的特异性受体,发挥多种生理功能。它对新生血管形成过程中的毛细血管基底膜降解、内皮细胞迁移增殖、胶原合成及小血管腔形成等均有明显的促进作用。在相对缺氧的环境下,成纤维细胞生长因子2提高心肌样细胞存活率。     

争光霉素A6和它在争光霉素复合物的地位

争光霉素A₅已鉴别为Bleomycin A₆,在争光霉素复合物中所占比例一般在10%左右,在某些批样中可高达15%以上。文献报告Bleomycin A₆在天然产的Bleomyein复合物中只有痕量。通过向发酵培养基中加入特定组分的末端胺可大大提高其特定组分在复合物中的含量比而其它组分的产生则不同程度地被抑制。但Bleomyein A₆例外,即使向培养基中加入其末端胺精胺(0.3mg/ml),在所产生的复合物中大大增多的组分是Bleomyein A₆,而Bleomycin A₆仍只有痕量。这表明争光霉素产生菌有和Bleomycin产生菌明显不同的特点。     

pcDNA3．1-VEGF165质粒转染骨髓基质干细胞后血管内皮生长因子的表达

目的:检测pcDNA3.1-VEGF165载体转染对兔骨髓基质干细胞血管内皮生长因子表达的影响。方法:实验于2005-07/2006-01在山东省青岛市市立医院中心试验室完成。①pcDNA3.1-VEGF165质粒由华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科杨述华教授惠赠。②选取1月龄新西兰大白兔1只,无菌条件下取胫骨和股骨,进行骨髓基质干细胞的分离与培养。③转染前24h计数细胞,每孔5×105细胞接种于6孔板,待骨髓基质干细胞达到80%～90%融合时准备转染,设立未转染组、空载体组和载体组。未转染组无特殊处理,空载体组转染pcDNA3.1载体,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165。④转染后72h,反转录聚合酶链反应检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165mRNA的表达;酶联免疫吸附法检测各组骨髓基质干细胞中血管内皮生长因子165蛋白的含量。结果:①骨髓基质细胞分离培养形态观察:初始分离的骨髓细胞呈圆形,大小不一;24h后有少量细胞贴壁;48h后贴壁细胞部分为成纤维样细胞;72h贴壁的成纤维样细胞数不断增加;96h后贴壁生长的细胞主要为梭形的成纤维样细胞;分瓶后细胞形成克隆;传代后细胞贴壁生长,分裂相增多,并不断增殖分化形成均一的梭形细胞。②转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165mRNA的表达情况:反转录聚合酶链反应检测到载体组在576bp处有明显条带,空载体组和未转染组均未见血管内皮生长因子165表达。③转染72h后各组细胞血管内皮生长因子165蛋白含量检测结果:酶联免疫吸附结果显示,载体组转染pcDNA3.1-VEGF165载体的骨髓基质细胞培养上清液中血管内皮生长因子165蛋白浓度为(170.1±14.3)ng/L,而空载体组与未转染组均未检测到血管内皮生长因子165蛋白表达,差异有显著性意义(t均=42.206,P=0.000)。结论:应用pcDNA3.1-VEGF165载体转染,可使兔骨髓基质干细胞获得外源性血管内皮生长因子165基因和蛋白的表达。