TNFR Ⅰ-IgGFc融合基因重组腺病毒表达载体的构建及其在骨髓基质干细胞的表达

目的 构建携带人肿瘤坏死因子受体Ⅰ胞外区和IgGFc融合基因的重组腺病毒载体(Ad-TNFRⅠ-IgGFc),体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨转TNFRⅠ-IgGFc基因的BMSCs治疗类风湿关节炎的可行性.方法 将TNFR Ⅰ-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,重组产生Ad-TNFRⅠ-IgGFc,PCR鉴定毒种正确后,进行扩增、纯化和滴度测定,转染培养至第2代BMSCs,利用RT-PCR、原位杂交、免疫组化方法,检测转染后细胞中TNFRⅠ-IgGFc的转录和表达.结果 成功构建了Ad-TNFRⅠ-IgGFc,感染性滴度达3×1010 TCID50/mL,转染后BMSCs在mRNA和蛋白水平均有TNFRⅠ-IgGFc表达.结论 构建的Ad-TNFRⅠ-IgGFc可有效转染BMSCs,并在其中高效表达,为将表达TNFRⅠ-IgGFc基因的BMSCs用于类风湿关节炎治疗的实验研究提供了基础.     

如何提高手术学教学中实验教师的水平

手术学是外科学的重要组成部分，是训练学生外科技术的基本手段，手术学教学的效果与手术学教学中的实验教师有着密不可分的关系。实验教师可以帮助学生树立严格的无菌观念，辅导如何正确地使用手术器械及掌握外科各项基本操作技能，使之养成严肃、认真、负责的科学作风和工作态度。提高手术学教学中实验教师的素质，对手术学的教学和一名医生的成长有着重要作用。本文就提高实验教师水平的措施报告如下。     

T细胞受体二次重排的基础与临床

重组激活基因(RAG)能被诱导再次表达引起T细胞受体(TCR)二次重排,进而在TCR库的形成和丰富中发挥重要作用.二次重排发生于外周者称为受体修正(receptor revision),发生于中枢者则称为受体编辑(receptor editing).研究发现,TCR编辑/修正可存在于肿瘤、感染、移植及自身免疫等疾病状态下,且与疾病发生有密切联系.目前,国内外已有学者利用动物模型或人类细胞研究TCR编辑/修正,并对其机制进行了初步探索.     

人血管内皮细胞生长因子基因克隆、表达与纯化

目的研究人血管内皮细胞生长因子121(hVEGF121)基因在pET-24a(+)中的表达,获得高效表达、具有生物学活性的rhVEGF121。方法提取人原髓白血病细胞(HL60)总RNA,RT-PCR扩增hVEGF121基因,经DNA序列分析后,克隆于高效原核表达载体pET-24a(+),并转化到大肠杆菌B121(DE3)中,经IPTG诱导表达,超滤复性,DEAESephamseFastFlow阴离子交换和SephacryS-100分子筛色谱纯化后,以HUVEC测定其生物学活性。结果SDS-PAGE结果显示,目的蛋白质以包涵体形式存在,表达量达菌体总蛋白质的20%,纯化后rhVEGF121纯度达95%以上,生物学活性检测证实,具有刺激HUVEC增殖的功能。结论在原核系统中实现了hVEGF121的高效表达。     

重组腺病毒Ad-HGF转染骨髓基质干细胞及其表达的实验研究

目的 构建人肝细胞生长因子(HGF)重组腺病毒表达载体,体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),检测HGF基因表达,探讨转HGF基因的BMSCs治疗股骨头缺血性坏死(ANFH)的可行性.方法 利用RT-PCR方法,从共表达人HGF-Met的NIH3T3-H0细胞株中扩增人HGF cDNA,插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒共转染HEK293细胞,重组产生重组腺病毒Ad-HGF,PCR鉴定毒种正确后,在293细胞中扩增、纯化,TCID50法测定感染性滴度,然后感染BMSCs,RT-PCR、原位杂交、免疫组化检测转染后细胞中HGF的转录和表达.结果 成功制备了Ad-HGF,感染性滴度为2.6×1010TCID50/ml,转染后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表达.结论 获得高表达人HGF基因的BMSCs,为其用于早期ANFH的治疗奠定了基础.     

鼻咽癌细胞株体外诱导同种异体T细胞TCR VβCDR3谱型和细胞毒性分析

目的 用鼻咽癌细胞株CNE2体外负载同种异体树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导T淋巴细胞,使之活化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL),观察其体外特异性杀伤和克隆性增殖.方法 用GM-CSF,IL-4和TNF-α体外诱导健康志愿者外周血单核细胞,用CNE2负载,使之分化为成熟DC,流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征.在IL-2的作用下,用负载CNE2抗原的DC诱导自身T细胞生成特异性CTL.乳酸脱氢酶释放法检测其特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术分析T细胞的克隆性.结果 健康志愿者外周血单核细胞体外在GM-CSF,IL-4和TNF-α诱导下获得具有典型表型特征的成熟DC,其诱导的CTL对CNE2有明显的特异性杀伤作用;PBMC的TCR Vβ CDR3谱型呈高斯分布,而诱导后的T细胞部分家族出现优势表达.结论 负载鼻咽癌抗原的同种异体DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用,优势表达的TCR Vβ CDR3家族对鼻咽癌治疗有潜在的临床应用价值.     

应用斑点ELISA快速研究鸡卵黄抗体IgY的理化性质

目的应用斑点ELISA研究卵黄抗体的理化性质,使多克隆抗体的性质得以确定,为今后更好地研究和利用该抗体奠定基础。方法将制备的卵黄抗体用不同的方法(加热、酸、碱、酶等)处理后,再用斑点ELISA检测卵黄抗体的剩余活性。结果IgY有很好的耐热性,巴氏消毒不会使IgY失活。卵黄抗体在pH>5和<9的环境下,37℃3h后仍保持部分活性。卵黄抗体在室温存放4个月后仍保持部分活性。在pH<5时,胃蛋白酶能发挥作用,使卵黄抗体失去活性。结论IgY的高度稳定性,使得这一多克隆抗体的保存和运输较方便,有利于IgY的推广和使用。     

大肠杆菌表达的人血管内皮细胞生长因子的复性与纯化研究

以包涵体的形式在大肠杆菌中表达人血管内皮细胞生长因子（VEGF121）,采用发酵罐进行工程菌的高密度发酵,得到菌干重46g／L,VEGF121包涵体4．5g／L。包涵体经洗涤、溶解、超滤法复性,得率为81％。复性后的目标蛋白经离子交换色谱及SepharcryS-100凝胶过滤色谱纯化,目标蛋白的纯度达到95％,目标蛋白的总得率31％。采用该工艺制备的VEGF121能刺激人脐静脉血管内皮细胞增殖,具有天然VEGF生物学活性。     

多表位HBV重组DNA疫苗的构建与免疫效果评价

目的探讨多表位乙型肝炎DNA疫苗诱导特异性细胞免疫应答及其治疗慢性乙型肝炎的潜能。方法筛选一组HBV的表位,并进行优化组合,辅以一定的旁侧序列,并合成目的基因片段HS。将它插入可人用的真核表达载体pVAX1中,构建出重组质粒PVAX-HS。通过重组质粒免疫小鼠,观察免疫动物体内CTL。结果酶切结果显示成功构建了PVAX-HSDNA疫苗,ELISPOT测定证实其可以在小鼠体内诱导产生特异性T细胞,51Cr释放实验证实,所诱导的T细胞中具有很强的CTL活性。结论PVAX-HSDNA疫苗免疫可诱导特异性细胞免疫应答,具有慢性病毒性乙型肝炎治疗性疫苗的潜能。     

肺结核患者外周血αβT细胞CDR3谱系研究

目的探讨活动性肺结核患者外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系漂移,为肺结核患者特异性T细胞免疫应答机制和免疫治疗研究提供基础。方法采用基因扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员及6例活动性肺结核患者PBMC中T细胞TCR CDR3谱型分布特征及患者TCRVα和Vβ基因家族的优势取用情况,对克隆性增生T细胞CDR3区进行序列分析。结果6例正常献血员外周血中TCR 32 Vα,24Vβ家族CDR3谱型均呈高斯分布(gaussian distribution),6例活动性肺结核患者出现不同Vα和Vβ家族优势取用,对部分单/寡克隆增生T细胞α,β链CDR3区基因进行测序,证实存在不同的CDR3序列。结论肺结核患者活动期外周血T细胞TCRα,β链CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达与结核患者细胞免疫应答机制有关,优势取用Vα,Vβ家族T细胞TCR CDR3序列的确定,为肺结核患者特异性T细胞免疫治疗研究提供基础。