软骨细胞接种小孔径聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架的方法选择

目的 探讨软骨细胞接种小孔径聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架的最佳接种方法. 方法 实验分3组(n=9):注射组、负压组、振荡组,取纤维蛋白原溶液混悬第2代软骨细胞,采用上述3种方法对孔隙率为92％、孔径为50 ～ 100 μm的PLGA支架进行细胞接种.48 h后,Hoechst33258法检测支架内DNA含量;接种并观察支架内含异硫氰酸荧光素的无细胞纤维蛋白原凝胶的分布;硬组织切片、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察支架内细胞分布.7d后,扫描电镜观察支架表面及内部的细胞形态.各组部分支架(n=3)植入裸鼠皮下,以无细胞PLGA支架为空白对照组,术后8周取出支架行甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,并计算累积吸光度(IOD)值. 结果 注射组、负压组、振荡组平均DNA含量分别为(755.79±80.50)、(657.32±89.68)、(650.18±106.33)ng/mg,各组比较差异均无统计学意义(F=1.214,P=0.361).无细胞纤维蛋白凝胶在各组中都均匀分布,DAPI染色显示注射组细胞分布较其他两组均匀.扫描电镜显示负压组和振荡组外周细胞较注射组多,而支架孔隙内仅注射组可见细胞黏附.注射组甲苯胺蓝、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色的IOD值均优于其他3组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 对于50 ～ 100 μm的小孑L径PLGA支架,注射法是一种快捷、高效的细胞接种方法.     

神经植入对大段组织工程骨成骨效果的一年观察

目的 观察在组织工程骨内植入神经束后大段组织工程骨的长期成骨效果.方法 新西兰大白兔64只,随机分为四组:A组,单纯组织工程骨组;B组,运动神经束植入组(股神经肌支);C组,感觉神经束植入组(隐神经);D组,感觉、运动神经束联合植入组.每只动物均在左侧股骨制作长1.5 cm的段缺性骨与骨膜缺损,钢板固定后在骨缺损处分别植入四种方法制备的组织工程骨.术后1、3、6、12个月行大体观察、X线和组织学定量观察成骨情况. 结果 术后1、3、6个月时,在组织工程骨内植入感觉神经或联合植入两种神经后,比单纯组织工程骨和运动神经束植入的修复效果均有明显提高.术后12个月时,各组骨再生情况基本一致,但新生骨组织出现一定程度的吸收,其外观较正常股骨细,新生骨组织与兔股骨牢固愈合,并开始塑形且出现髓腔再通. 结论 在组织工程骨内植入感觉神经可促进成骨,而植入运动神经未见促进作用;组织工程骨可以修复兔大段骨缺损;该实验新生骨组织的吸收可能与模型的制作方法有关.     

仿生组装纳米羟基磷灰石/壳聚糖骨修复材料的制备及其生物相容性研究

目的 探讨以一种简单、廉价的方法制备纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HA/CS)复合材料,并评价其理化特征和生物相容性. 方法采用原位沉析和冷冻干燥法制备n-HA/CS支架,通过扫描电镜、组织切片染色、X线衍射和傅立叶红外光谱分析其微观形貌和组成;采用万能材料试验机分析材料的力学性能.采用材料浸提液和表面接种考察n-HA/CS复合材料对第3代人骨髓基质干细胞(hBMSCs)黏附、增殖的影响,评估其细胞相容性.将n-HA/CS复合材料植入新西兰大白兔背部肌袋,经组织学染色后评价其组织相容性. 结果 n-HA/CS复合材料具有多孔结构,孔隙率为(88.65±2.34)%,孔径为(112.63±20.47) μm,HA晶体颗粒长度为200～700 nm,且分散均匀;X线衍射和红外光谱分析表明合成的HA是含CO32-弱结晶纳米晶体.材料的断裂强度为(1.47±0.15)MPa,弹性模量为(37.52±3.43)kPa,可满足非负重部位骨修复要求.n-HA/CS材料浸提液未明显抑制hBMSCs的增殖,直接接种在n-HA/CS复合材料表面的细胞黏附、增殖功能正常;组织相容性实验也表明,植入4周后组织炎性反应明显减轻,12周后材料基本降解并由新生组织爬行替代. 结论采用原位沉析和冷冻干燥法制备的n-HA/CS复合材料具有良好的理化性质和生物相容性,有望应用于组织工程骨的构建.     

富血小板血浆对体外培养骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的 探讨不同浓度的富血小板血浆(PRP)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖及成骨能力的影响.方法 取大鼠骨髓组织,密度梯度离心法体外分离培养BMSCs.取第3代细胞接种,分别加入含0.5％、1％、2％、5％、10％ PRP的成骨诱导液或DMEM培养基进行培养,并以加入不含PRP的成骨诱导液或DMEM培养基培养(0 PRP)的BMSCs作对照.采用XTr比色法测定BMSCs的增殖情况.分别于培养3、7、11d时用ELISA法测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性,培养7、14、21 d时用放射免疫法检测骨钙素(OCN)表达量,培养21 d时用茜素红染色观察钙化结节形成能力.结果 成骨诱导培养的前7d,PRP可促进BMSCs增殖,成骨诱导培养7d以后,PRP也可促进BMSCs的成骨分化,且随着PRP浓度的增加,促细胞增殖、分化和成骨能力逐渐增强.PRP促进BMSCs内ALP活性和OCN表达的作用也呈剂量依赖性.成骨诱导培养21 d后,5％、10％的PRP诱导钙化结节形成能力优于0.5％、1％和2％的RPR,0 PRP培养的BMSC仅见少量钙化结节形成.结论 在体外成骨诱导培养条件下,RPR能有效促进BMSCs的生长增殖和成骨分化,以浓度10％为最佳.     

异体骨髓间充质干细胞联合自体PRP促进皮肤慢性溃疡创面愈合的实验研究

目的探讨在皮肤慢性溃疡处注射异体骨髓间充质干细胞（BMSC）和自体富血小板血浆（PRP）对皮肤的再生和重建的作用。方法选择健康6—8周龄SD大鼠17只,取其中1只大鼠,采用全骨髓法体外分离培养BMSC,取传至第3代细胞,移植前48h行DiI荧光标记。剩余16只大鼠麻醉后制作全层皮肤缺损模型,于其背部脊柱两侧制作4个全层皮肤缺损创面并随机分为4组。A组局部注射异体BMSC悬液联合PRP治疗,B组局部单纯注射异体BMSC悬液,C组局部单纯注射PRP治疗,D组局部注射等量生理盐水。治疗7、14d采集标本观察结果。采用大体观察、苏木素一伊红染色、荧光显微镜观察创面愈合情况。结果体外分离培养的BMSC具有成脂、成骨、成神经分化潜能。在治疗后7、14d,A、B、C组创面愈合时间均短于D组,A组愈合时间比B、C组缩短。组织学观察发现A组新生真皮相应时间点的厚度、血管和胶原纤维均明显多于其他3组。结论在皮肤慢性溃疡处联合应用异体BMSC和自体PRP,能加速真皮的修复和重建。     

血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对血管内皮生长因子表达的影响

目的 探讨血管束植入组织工程骨修复兔股骨缺损对局部血管内皮生长因了(VEGF)表达的影响.方法 将兔自体骨髓基质下细胞经诱导后与β-磷酸三钙材料复合,植入制备的兔股骨缺损处,其中实验组在材料侧槽中植入股骨的动静脉血管束,对照组则单纯植入组织工稗骨,分别于术后2、4、8、12周通过形态学检测新生骨量,免疫组织化学方法检测新生骨中VEGF的表达量.结果 随着时间进展,各组成骨量逐渐增加,差异有统计学意义(P<0.05),并且从第4周开始实验组成骨量高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);符时问点实验组新生骨中VEGF的表达最均高于对照组,差异有统汁学意义(P<0.05),且4周时达到最人值.结论 血管束植入组织工程骨可明显增加新生骨中VEGF的表达并能促进骨缺损的修复.     

脂肪干细胞与自体富血小板血浆载体复合物体内构建血管化组织工程脂肪

背景：血运重建机制是组织工程化脂肪组织成功构建的决定性因素。 目的：观察脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内构建血管化组织工程脂肪的可行性。 方法：从健康成年人吸脂术后的脂肪组织中分离脂肪干细胞并行原代及传代培养,将第3代经BrdU标记的脂肪干细胞向脂肪细胞定向诱导2周后,制成浓度为5×1010 L-1细胞悬液。由0.5 mL细胞悬液、100 μL富血小板血浆工作液或DMEM培养基与0.5 mL纤维蛋白胶组成实验组和对照组移植物,分别植入裸鼠背部皮下。 结果与结论：植入后8周取材：①实验组可见血管明显增生并长入材料,呈轻度纤维包裹;对照组有少量血管长入材料中,也有轻度纤维包裹现象。实验组新生组织湿质量大于对照组(P < 0.01)。②苏木精-伊红染色均可见移植物中有新生脂肪组织形成和不同程度的微血管长入;实验组微血管数多于对照组(P < 0.01)。③新生组织免疫荧光染色示,两组新生脂肪细胞的胞核及部分微血管内皮细胞的胞核呈现绿色荧光。说明脂肪干细胞与自体富血小板血浆和纤维蛋白胶载体复合物在体内可构建血管化组织工程脂肪,脂肪干细胞与自体富血小板血浆共同参与新生脂肪组织的血管化过程,自体富血小板血浆能促进组织工程构建物的血运重建,保证更多种子细胞的成活。