人胎儿肝脏来源C-kit+细胞的特征*◆

背景：在成年动物肝脏中干细胞含量很少,且体外大量扩增并保持未分化状态的问题仍然没有很好的解决,许多科研者预测胚胎肝干细胞可能具有诱人的临床应用价值。近年来C-kit被选择作为研究肝干细胞的共同标志,并发现C-kit抗原参与肝干细胞的生长和发育。 目的：对胎儿肝脏来源的C-kit+细胞进行分离培养,观察其体外生长和分化的特征。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-10/2008-03在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成。 材料：肝脏C-kit+细胞来源于32例流产胎儿,由南京大学医学院附属鼓楼医院提供。Percoll分离液为Pharmacia公司产品,Ficoll分离液为天津灏阳生物制品科技有限责任公司产品,表皮生长因子、肝细胞生长因子为R&D公司产品。 方法：无菌状态下取出胎儿肝脏,以胶原酶消化法和机械分离法获得胎儿肝脏来源单细胞悬液,分别采用1.070 g/mL Percoll分离液和1.077 g/mL Ficoll分离液进行密度梯度离心,吸取界层细胞,添加含体积分数为0.1 FBS、20 μg/L肝细胞生长因子、40 μg/L表皮生长因子的DMEM/F12新鲜培养基诱导9 d。 主要观察指标：胎儿肝脏中C-kit+细胞计数,界层细胞形态、生长特征、表型及C-kit标志的鉴定,界层细胞诱导分化结果。 结果：未经分离的新鲜胎儿肝脏细胞中C-kit+细胞所占比例仅为1.28%,使用Percoll和Ficoll分离液获取的界层细胞分布在三角形区域内的C-kit+细胞所占比例显著增加,分别为74.21%和72.15%,但绝对数量仍然有限。两种分离液获取的界层细胞在形态、生长状况方面基本相似,免疫细胞化学染色鉴定后大体可分为4类：第1类细胞为C-kit+细胞集落,第2类细胞既呈CD29+、CD90+、CD34-、C-kit-（间充质干细胞表型特征）,又较弱地表达细胞角蛋白19（胆管细胞特异性标志）,第3类细胞较强地表达细胞角蛋白19,不表达C-kit抗原,第4类细胞高表达CD45,微弱表达CD34、CD90、C-kit。诱导后,界层细胞角蛋白19呈强阳性表达,不表达C-kit、白蛋白、甲胎蛋白及细胞角蛋白18。 结论：胎儿肝脏中的C-kit+细胞数量很少,Percoll和Ficoll分离液均可提高C-kit+细胞的得率。胎儿肝脏中可能存在的一类间充质-胆管细胞的中间态细胞,这种细胞可能有促进C-kit+细胞生长的作用。间充质干细胞可向胆管细胞分化。     

人胚胎心脏来源间充质干细胞的获取及其生物学特征

背景：目前尚缺乏关于人胚胎心脏来源间充质干细胞各代在体外生物学特征的报道。 目的：以不同培养方法获取人胚胎心脏来源的间充质干细胞，并观察其生物学特征，筛选适合作为心肌修复细胞源的传代次数。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察，在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成。 材料：流产人胚胎10例，均来自南京大学医学院附属鼓楼医院，经产妇及家属知情同意，实验获得医学伦理委员会批准。 方法：取心脏组织，剪为约1mm的碎块，胶原酶消化过筛。获得单细胞悬液采用细胞培养法，向细胞悬液中添加10％FBS的DMEM／F12培养基;消化后的残余组织采取组织块培养法，放于培养板中，于37℃、体积分数为0．05的CO2培养箱中放置1．5h后．添加10％FBS的DMEM/F12培养基。两种方法均采取直接贴壁方式获取贴壁细胞，常规传代。 主要观察指标：倒置显微镜观察心脏组织来源各代细胞的形态特征：流式细胞仪检测各代细胞表面标志，分析细胞周期。 结果：细胞培养与组织块培养至P3代后，细胞形态相似且均呈梭形。细胞培养的P3和P4代以及组织块培养的细胞群中CD29和CD44阳性比例较高．而c—Kit、CD31、CD45、GATA-4和c—Tnt均呈阴性：细胞培养的P2和P3代细胞群间充质干细胞的比例最大．组织块培养的细胞中P3代细胞群间充质干细胞的比例最大;且P2-P4代细胞状态较好．当传至P7代时细胞生长速度开始减慢。原代-P5代细胞绝大部分处于静息状态，但保留自我更生的潜能，符合干细胞特性。 结论：利用细胞培养法或组织块培养法都可以成功获得人胚胎心脏来源间充质干细胞，P3代细胞更适合予心脏修复的细胞移植治疗。     

冻干重组水蛭素Ⅲ的稳定性研究

目的研究冻干重组水蛭素Ⅲ的稳定性,为选择包装材料、确定贮藏条件和有效期提供依据。方法通过影响因素实验,加速实验和长期稳定性实验,对其外观性状、溶解性、干燥失重、活性等进行研究。结果该制剂的主要影响因素是湿度和温度,光照影响不大;加速试验条件下6个月时活力能保持80%左右,其他指标正常;长期稳定性试验条件下,放置12个月后,各项指标均符合质量标准。结论该制剂可在室温下稳定保存12个月。     

胎儿心脏来源细胞的分离培养及鉴定*★

目的：胎儿心脏正处于组织器官形成和发育时期，其中的细胞数量和增殖能力应该高于成体组织，但是目前关于培养人胎儿心脏来源细胞的方法以及基本生物学特征还鲜见报道。实验拟建立体外培养胎儿心脏来源细胞的方法，探讨心脏来源细胞基本的生物学特征和细胞种类。 方法：实验于2005-10/2007-05在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成。①实验材料：水囊引产的12~18周胎儿10例由南京大学医学院附属鼓楼医院提供，实验经产妇及家属同意，并经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：取胎龄12~18周水囊引产的胎儿心脏，将消化后获得的细胞培养于添加内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、心肌营养素及含10% FBS 的DMEM/F12培养基中。③实验评估：应用显微镜观察细胞的形态特征，采用RT-PCR检测培养前后心脏来源细胞干细胞标志基因等基因的表达，流式细胞仪检测培养前及培养19 d后细胞的表面标志。 结果：①心脏来源的细胞可以生长增殖。培养16 d后出现克隆，并有类似生长中心的区域形成，类似生长中心区域内的细胞较小，形态接近圆形，细胞核占细胞比例大，而周围的细胞形状多为梭形核多角形，细胞核所占的比例较小，并且显微镜下可见正在分裂的细胞。②RT-PCR检测显示，胎儿心脏组织分离获得的心肌细胞中表达c-Kit、KDR、 GATA-4、Nkx-2.5、MEF-2c，不表达c-Tnl。培养19 d后细胞中GATA-4、KDR、 MEF-2c表达量降低,不表达c-Kit，Nkx-2.5和c-Tnl。③流式细胞仪检测发现培养19 d后细胞群中CD29和CD44高表达，CD45、GATA-4和c-Tnt低表达。 结论：建立了一种体外培养胎儿心脏来源细胞的方法，并确定细胞群中有心脏来源的间充质干细胞和心肌祖细胞。     

胎儿心脏来源细胞的分离培养及鉴定

目的:胎儿心脏正处于组织器官形成和发育时期,其中的细胞数量和增殖能力应该高于成体组织,但是目前关于培养人胎儿心脏来源细胞的方法以及基本生物学特征还鲜见报道.实验拟建立体外培养胎儿心脏来源细胞的方法,探讨心脏来源细胞基本的生物学特征和细胞种类.方法:实验于2005-10/2007-05在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成.①实验材料:水囊引产的12～18周胎儿10例由南京大学医学院附属鼓楼医院提供,实验经产妇及家属同意,并经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:取胎龄12～18周水囊引产的胎儿心脏,将消化后获得的细胞培养于添加内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、干细胞生长因子、心肌营养素及含10?S的DMEM/F12培养基中.③实验评估:应用显微镜观察细胞的形态特征,采用RT-PCR检测培养前后心脏来源细胞于细胞标志基因等基因的表达,流式细胞仪检删培养前及培养19 d后细胞的表面标志.结果:①心脏来源的细胞可以生长增殖.培养16 d后出现克隆,并有类似生长中心的区域形成,类似生长中心区域内的细胞较小,形态接近圆形,细胞核占细胞比例大,而周围的细胞形状多为梭形核多角形,细胞核所占的比例较小,并且显微镜下可见正在分裂的细胞.②RT-PCR检测显示,胎儿心脏组织分离获得的心肌细胞中表达c-Kit、KDR、GATA-4、Nkx-2.5、MEF-2c,不表达c-Tnl.培养19 d后细胞中GATA-4、KDR、MEF-2c表达量降低,不表达c-Kit,Nkx-2.5和c-Tnl.③流式细胞仪检测发现培养19 d后细胞群中CD29和CD44高表达.CD45、GATA-4和c-Tnt低表达.结论:建立了一种体外培养胎儿心脏来源细胞的方法,并确定细胞群中有心脏来源的间充质干细胞和心肌祖细胞.     

人胎儿肝脏来源C-kit^＋细胞的特征

背景:在成年动物肝脏中干细胞含量很少,且体外大量扩增并保持未分化状态的问题仍然没有很好的解决,许多科研者预测胚胎肝干细胞可能具有诱人的临床应用价值.近年来C-kit被选择作为研究肝干细胞的共同标志,并发现C-kit抗原参与肝干细胞的生长和发育.目的:对胎儿肝脏来源的C-kit+细胞进行分离培养,观察其体外生长和分化的特征.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2008-03在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成.材料:肝脏C-kit+细胞来源于32例流产胎儿,由南京大学医学院附属鼓楼医院提供.Percoll分离液为Pharmacia公司产品,Ficoll分离液为天津灏阳生物制品科技有限责任公司产品,表皮生长因子、肝细胞生长因子为R&D公司产品.方法:无菌状态下取出胎儿肝脏,以胶原酶消化法和机械分离法获得胎儿肝脏来源单细胞悬液,分别采用1.070g/mL Percoll分离液和1.077 g/mL Ficoll分离液进行密度梯度离心,吸取界层细胞,添加含体积分数为0.1 FBS、20 μg/L肝细胞生长因子、40 μg/L表皮,上长因子的DMEM/F12新鲜培养基诱导9 d.主要观察指标:胎儿肝脏中C-kit+细胞计数,界层细胞形态、生长特征、表型及C-kit标志的鉴定,界层细胞诱导分化结果.结果:未经分离的新鲜胎儿肝脏细胞中 C-kit+细胞所占比例仪为1.28%,使用Percoll和Ficoll分离液获取的界层细胞分布在二角形区域内的C-kit+细胞所占比例显著增加,分别为74.21%和72.15%,但绝对数量仍然有限.两种分离液获取的界层细胞在形态、生长状况方面基本相似,免疫细胞化学染色鉴定后大体可分为4类:第1类细胞为C-kit+细胞集落,第2类细胞既呈CD29+、CD90+、CD34+、C-kit(间充质干细胞表型特征),又较弱地表达细胞角蛋白 19(胆管细胞特异性标志),第3类细胞较强地表达细胞角蛋白19,不表达C-kil抗原,第4类细胞高表达CD45,微弱表达CD34、CD90、C-kit.诱导后,界层绌胞角蛋白19呈强阳性表达,不表达C-kit、白蛋白、甲胎蛋白及细胞角蛋白18.结论:胎儿肝脏中的C-kit+细胞数量很少,Percoll和Ficoll分离液均可提高C-kit+细胞的得率.胎儿肝脏中可能存在的一类间充质-胆管细胞的中间态细胞,这种细胞可能有促进C-kit+细胞生长的作用.间充质干细胞可向胆管细胞分化.