C57BL/6小鼠来源的胚胎干细胞建系及体外定向造血分化的研究

哺乳动物的胚胎造血表现为时间和空间的连续变化。既往研究表明，129小鼠来源的胚胎干细胞系（em-bryonic stem cells，ES细胞）的体外分化能在一定程度上模拟胚胎造血。为研究C57BL/6小鼠来源的ES细胞系体外定向造血细胞分化的特点，分离C57BL/6小鼠3.5天囊胚的内细胞团建立ES细胞系并采用常规方法鉴定，应用体外二步分化法形成拟胚体并进行集落培养，细胞化学染色和RT-PCR鉴定造血前体细胞。结果表明：所建ES细胞系MES-1符合建系标准，其体外分化后可在不同阶段的拟胚体中发现多种造血前体细胞的有序出现，包括原始红系前体细胞，永久红系前体细胞，混合集落形成细胞和粒单系集落形成细胞。RT-PCR分析显示，拟胚体表达多种造血特异性的转录因子和造血标记。结论：自C57BL/6小鼠建立的ES细胞系MES-1体外定向造血细胞分化在一定程度上能模拟胚胎造血。     

人胎盘间充质干细胞在不同改性处理聚苯乙烯表面的生长效应

背景：人胎盘间充质干细胞(Placenta mesenchymal stem cells, PMSCs)是细胞治疗、再生医学以及免疫调节治疗的重要种子细胞,其培养表面的研究是关系优化PMSCs培养体系的重要课题。 目的：观察磺化法、次大气压等离子技术和多聚赖氨酸包被技术改性的聚苯乙烯培养表面对人PMSCs体外培养的影响。 设计、时间及地点：体外对比观察实验,于2007-03/2008-10在北京纵横洋洲医药生物技术公司生物塑料实验室完成。 材料：聚苯乙烯3.5 cm2培养皿和24孔培养板由北京纵横洋洲医药生物技术有限公司提供,多聚赖氨酸购自美国Sigma公司。人正常分娩期胎盘由北京人民医院提供,并经产妇知情同意。 方法：以磺化法、次大气压等离子技术、多聚赖氨酸包被技术改性聚苯乙烯培养表面,将体外分离的人胎盘小叶中有核细胞分别接种到不同改性处理的培养表面,贴壁法获得PMSCs克隆,传代培养。 主要观察指标：观察不同改性处理的聚苯乙烯培养表面的表面张力;PMSCs在不同培养表面培养的原代培养克隆率、接种培养贴壁率;测定细胞生长曲线。 结果：聚苯乙烯培养表面采用不同方法改性后,其表面张力：等离子组>多聚赖氨酸组>磺化组>对照组;培养表面表面张力越大,人PMSCs原代培养克隆率和继代培养贴壁率越大,而多聚赖氨酸包被的培养表面更有利于原代分离人PMSCs;培养表面表面张力的增加能有效缩短人PMSCs接种后恢复期。 结论：鉴于多聚赖氨酸改性大幅增加了培养成本并有污染细胞的可能,建议采用多聚赖氨酸改性表面实施PMSCs原代培养,等离子改性表面实施PMSCs继代培养。     

RAGE、sRAGE在结肠癌中的表达及其临床意义

目的：本研究通过检测结肠癌组织晚期糖基化终末产物受体（ the receptor for advanced glycation end product,RAGE）和血清可溶性RAGE（ soluble RAGE,sRAGE）的表达水平,探讨其在结肠癌发生、发展过程中的作用及其临床意义。方法：本研究纳入49例非糖尿病结肠癌（ I、II、III期）患者,以免疫组织化学评分法（ immunohistochemical score,IHS）评价结肠癌RAGE表达水平,以ELISA法检测患者外周血血清sRAGE浓度。结果：结肠癌组织RAGE表达水平（IHS为1.24±0.48）显著高于癌周组织（IHS为0.50±0.25）（P﹤0.05）, III期（IHS为1.42±0.51）显著性高于I期（IHS为1.01±0.35）（P﹤0.05）和II期（IHS为1.11±0.42）（P﹤0.05）;低分化结肠癌组织（IHS为1.58±0.49）显著高于中分化（IHS为1.08±0.45）（P﹤0.05）和高分化结肠癌组织（IHS为1.02±0.27）（P﹤0.05）。结肠癌患者血清sRAGE表达水平术前、术后分别为（344.77±68.06）ng/L、（265.43±76.85）ng/L,二者相比有显著性差异（ P ﹤0.05）,而且分别与健康志愿者 sRAGE （149.97±30.12）ng/L相比有显著性差异（ P﹤0.05）,但sRAGE表达水平与TNM分期、结肠癌组织分化程度没有关联。结肠癌组织RAGE高表达患者术前血清sRAGE浓度（415.02±85.08）ng/L高于中表达（334.26±44.56）ng/L和低表达（335.95±78.48）ng/L患者（P﹤0.05）。结论：结肠癌组织RAGE表达水平与分化程度呈负相关趋势,与TNM分期呈正相关趋势,作为术后诊断指标有一定的临床意义。血清sRAGE浓度与结肠癌组织RAGE表达水平呈正相关趋势,但与TNM分期和结肠癌组织分化程度没有关联,作为术前诊断指标仅能代表结肠癌风险,但无法考量结肠癌的恶性程度和进展情况。     

不同多羟基化合物对小鼠胚胎干细胞低温贮存的影响

背景:胚胎干细胞的长期低温贮存成为胚胎干细胞研究和应用的重要环节。传统的低温贮存保护剂主要包含二亚基亚砜、甘油、动物血清等,对于许多细胞类型并不能有效保证细胞的存活率,甚至于损失了细胞的某些功能。目的:开发适用于小鼠胚胎干细胞的低温贮存试剂。设计:观察实验。单位:广州医学院从化学院生理教研室与科宇联合干细胞生物技术有限公司。材料:实验于2004-10/2005-09在科宇公司实验室完成。小鼠细胞系mES-1为军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学研究室惠赠。方法:将mES-1维持培养收集的细胞低温贮存。实验以二亚基亚砜为主要的低温贮存保护剂。按低温保护液成分不同分4组:对照组低温保护液包含DMEM(高糖)、10%二亚基亚砜、10%胎牛血清、10mg/mL抗坏血酸、0.18mg/mL肌醇、0.44mg/mL叶酸,甘露糖组在对照组的基础上补充7.56mg/mL甘露糖,海藻糖组补充34.23mg/mL海藻糖,蔗糖组补充41.94mg/mL蔗糖。观察不同多羟基化合物对小鼠胚胎干细胞低温贮存后存活率和多向分化能力的影响。主要观察指标:胚胎干细胞集落形成率和拟胚体形成率。结果:①冻存后各低温保存剂组的胚胎干细胞集落形成率均比冻存前有显著性降低[对照组:(24.0±8.8)%,甘露糖组:(42.0±10.1)%,海藻糖组:(84.0±8.2)%,蔗糖组:(70.0±14.2)%,冻存前:(95.0±4.7)%,P均<0.05],其中海藻糖组的胚胎干细胞集落形成率明显高于其他低温保护剂组(P<0.05)。②海藻糖组的拟胚体形成率高于对照组和甘露糖组[(90.0±5.2)%,(80.0±6.9)%,(82.0±9.6)%,P均<0.05]。与蔗糖组相比,差异无显著性意义。结论:以海藻糖为核心低温保护剂成分可有效维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力和多向分化能力。     

不同多羟基化合物对小鼠胚胎干细胞低温贮存的影响

目的:研究开发适用于小鼠胚胎干细胞(EmbryonicStemCell,ES细胞)的低温贮存试剂。方法:以DM SO为主要低温贮存保护剂检测不同多羟基化合物对小鼠胚胎干细胞低温贮存后存活率和多向分化能力的影响。结果:在含有DMEM(高糖)、10 %DMSO、10 %FBS、10mg/mL抗坏血酸、0 .18mg/mL肌醇、0 .4 4mg/mL叶酸的低温保护剂中补充3 4 .2 3mg/mL海藻糖能够有效维持小鼠胚胎干细胞的自我更新能力和多向分化能力。结论:本研究以DMSO和海藻糖为主要试剂开发了一种适用于小鼠胚胎干细胞的低温贮存试剂     

RAGE和sRAGE在胃癌中的表达及其临床意义

通过检测胃癌组织晚期糖基化终末产物受体（RAGE）和血清可溶性RAGE（sRAGE）表达水平,探讨其在胃癌发生过程中的作用及其临床意义。方法为研究胃癌组织RAGE表达水平,纳入非糖尿病胃癌患者（Ⅰ～Ⅲ期）38 例的病理组织蜡块,10 例癌周组织（癌组织边缘≥5 cm）为对照,以免疫组织化学法染色评价胃癌组织RAGE 表达水平。为检测外周血sRAGE表达水平,采集38 例胃癌患者（Ⅰ～Ⅲ期）术前24 h、术后7 d肘静脉血2 ml,以30例健康捐献者外周血为对照,分离血清,以酶联免疫吸附法检测sRAGE浓度。结果RAGE 在正常组织和胃癌组织均有表达,胃癌组织表达水平更高（p <0.05）,而与TNM 分期和病理组织分型无关（p >0.05）。胃癌患者手术前后血清sRAGE 表达水平高于健康捐献者（p <0.05）,术后血清sRAGE水平降低（p <0.05）,但Ⅱ、Ⅲ期患者术后sRAGE 水平高于Ⅰ期患者（p <0.05）。结论胃癌组织RAGE 表达水平上调,可作为病理组织学辅助诊断指标;胃癌患者血清sRAGE 水平上调作为术前辅助诊断指标,有一定临床意义。     

小鼠骨髓间充质干细胞对胚胎干细胞造血分化的影响

骨髓间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞 ,在体外具有一定的造血支持作用 ,与造血干细胞共移植可促进其植入。本研究旨在初步探讨应用小鼠骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养作为一种新的分化体系的可行性。首先分离、培养并鉴定小鼠骨髓间充质干细胞 ,然后利用扩增培养的骨髓间充质干细胞与胚胎干细胞共培养 ,通过造血集落培养和RT PCR观察造血分化的特点。结果表明 ,分离、扩增培养至第四代之后的骨髓间充质干细胞形态均一 ,高表达Sca 1,CD2 9,CD4 4和CD10 5 ,而CD34和CD4 5等造血与内皮细胞特异性表面标志呈阴性 ;特异性诱导体系内传代后 (>4代 )的骨髓间充质干细胞可向脂肪细胞和成骨细胞分化。与悬浮分化体系相比 ,骨髓间充质干细胞共培养体系中初始分化的胚胎干细胞含有显著增加的拟胚体形成细胞而没有造血集落形成细胞。此外 ,RT PCR检测发现 :共培养细胞表达胚胎干细胞特异性转录因子Oct 4 ,而造血标记Flk 1,GATA 1和 β H1为阴性。结论 :间充质干细胞在一定程度上抑制了胚胎干细胞的初始分化 ,但是共培养体系来源的拟胚体产生造血集落的能力显著高于悬浮体系     

人胎盘问充质干细胞在不同改性处理聚苯乙烯表面的生长效应

背景:人胎盘间充质干细胞(Placenta mesenchymal stem cells,PMSCs)是细胞治疗、再生医学以及免疫调节治疗的重要种子细胞,其培养表面的研究是关系优化PMSCs培养体系的重要课题.目的:观察磺化法、次大气压等离子技术和多聚赖氨酸包被技术改性的聚苯乙烯培养表面对人PMSCs体外培养的影响.设计、时间及地点:体外对比观察实验,于2007-03/2008-10在北京纵横洋洲医药生物技术公司生物塑料实验室完成.材料:聚苯乙烯3.5 cm2培养皿和24孔培养板由北京纵横洋洲医药生物技术有限公司提供.多聚赖氨酸购自美国Sigma公司.人正常分娩期胎盘由北京人民医院提供,并经产妇知情同意.方法:以磺化法、次大气压等离子技术、多聚赖氨酸包被技术改性聚苯乙烯培养表面,将体外分离的人胎盘小叶中有核细胞分别接种到不同改性处理的培养表面,贴擘法获得PMSCs克隆,传代培养.主要观察指标:观察不同改性处理的聚苯乙烯培养表面的表面张力;PMSCs在不同培养表面培养的原代培养克隆率、接种培养贴壁率;测定细胞生长曲线.结果:聚苯乙烯培养表面采用不同方法改性后,其表面张力:等离子组>多聚赖氨酸组>磺化组>对照组:培养表面表面张力越大,人PMSCs原代培养克隆率和继代培养贴壁率越大,而多聚赖氨酸包被的培养表面更有利于原代分离人PMSCs;培养表面表面张力的增加能有效缩短人PMSCs接种后恢复期.结论:鉴于多聚赖氨酸改性大幅增加了培养成本并有污染细胞的可能,建议采用多聚赖氨酸改性表面实施PMSCs原代培养,等离子改性表面实施PMSCs继代培养.