变性温度和时间对实时定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响**☆

背景：在实时荧光定量聚合酶链反应检测过程中，由于设计的热循环参数不同，检测结果常会出现假阳性或假阴性。 目的：变性温度、变性时间以及聚合酶链反应运行的温度特性对实时荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2007-07-06/08在上海市安图医院PCR实验室完成。 材料：LightCycler 荧光聚合酶链反应检测仪由美国罗氏公司提供，乙型肝炎病毒核酸扩增聚合酶连反应荧光定量检测试剂盒由深圳匹基公司提供。 方法：聚合酶链反应运行程序条件：变性温度分别为88~97 ℃，变性时间分别为5 s和40 s，退火和延伸60 ℃，40 s，循环数40。 主要观察指标：乙肝病毒遗传物质的数量。 结果：聚合酶链反应运行温度上冲和下冲比较严重；变性时间对DNA浓度较低的样本影响很大，DNA很难被检测出；变性温度超过95 ℃，变性时间超过40 s时，检测到的DNA的量明显降低；变性时间小于20 s时，容易出现假阴性。 结论：变性时间太短、变性温度太高且变性时间太长容易造成乙型肝炎病毒检测出假阴性。     

小切口常规气管切开术的临床观察与探讨

目的:常规气管切开术采用小切口术式的临床观察与探讨。方法:各科需行气管切开的重症病人采用小切口常规气管切开术116例,回顾性分析常规的气管切开术(Surgical tracheostomy,ST)104例,经皮气管切开术(percutaneous dilational tracheostomy,IPDT)48例,结果:ST手术耗时20~40min,平均20min左右。IPDT手术耗时仅6-8min,平均7min。ST小切口手术需耗时8~20min,平均14min左右。结论:小切口常规气管切开术与经皮气管切开术基本具有同样的简单、快速、损伤小的特点,可在临床广泛应用。     

反复冻融对血清HBVDNA定量检测结果的影响

目的研究反复冻融对血清HBV DNA定量检测结果的影响。方法采集15例慢性乙型肝炎患者静脉血，离心后获得血清标本。将各血清标本于-20℃保存24h，室温解冻lh，完成第1次冻融循环，此后按相同步骤依次进行第2-6次冻融循环。第1次冻融循环前（第0次冻融循环）和每次冻融循环后均取少量血清，采用荧光实时定量PCR（FQ-PCR）技术进行HBV DNA定量检测，计算各血清标本每次冻融循环相对于第0次冻融循环的HBV DNA拷贝数的相对变化量。采用一元线性回归分析方法分析处理实验数据。结果15份血清标本HBV DNA定量检测结果有效范围为5．21×10^2～3．43×10^7拷贝／ml。血清标本HBV DNA定量检测结果显示，在第6次冻融循环的15份血清标本中，有14份血清标本HBV DNA拷贝数与基准水平比较均略有降低；经6次冻融循环后，累计有18．89％（17／90）的血清标本HBV DNA拷贝数略高于基准水平，81．11％（73／90）的血清标本HBV DNA拷贝数略低于基准水平；经2、4、6次冻融循环后，HBV DNA拷贝数与基准水平比较升高〉20％的累计血清标本数（依次为1、2、2份）均分别低于降低〉20％的累计血清标本数（依次为2、4、5份）。一元线性回归分析显示，每次冻融循环后HBV DNA拷贝数与基准水平比较降低约1.4％。结论血清冷冻时间〈24h时，反复冻融后血清标本HBV DNA定量检测结果可基本保持稳定。     

定量PCR检测乙肝病毒DNA实验中变性温度和时间的影响

目的 探讨PCR仪温度特性及变性温度、变性时间对实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的影响.方法 分析比较变性温度范围为88℃-97℃,变性时间分别为5 s和40 s,退火和延伸60℃,40 s,循环数40的实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒的效果.结果 变性温度超过97℃或者变性时间超过40 s.检测到的DNA的量明显降低;变性时间小于20 s,模板含量较低的样本难以检出.结论 变性初期或退火初期PCK温度与程序设置温度偏差较大;变性时间不应超过95℃,否则,检测到的DNA数量将显著降低;变性时间不应小于20 s或超过40 s,否则容易导致假阴性.     

变性温度和时间对实时定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响

背景：在实时荧光定量聚合酶链反应检测过程中，由于设计的热循环参数不同，检测结果常会出现假阳性或假阴性。 目的：变性温度、变性时间以及聚合酶链反应运行的温度特性对实时荧光定量聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒的影响。 设计、时间及地点：对比观察实验，于200707～06／08在上海市安图医院PCR实验室完成。 材料：LightCycler荧光聚合酶链反应检测仪由美国罗氏公司提供，乙型肝炎病毒核酸扩增聚合酶连反应荧光定量检测试剂盒由深圳匹基公司提供。 方法：聚合酶链反应运行程序条件：变性温度分别为88～97℃，变性时间分别为5S和40S，退火和延伸60℃，40S，循环数40。 主要观察指标：乙肝病毒遗传物质的数量。 结果：聚合酶链反应运行温度上冲和下冲比较严重；变性时间对DNA浓度较低的样本影响很大，DNA很难被检测出；变性温度超过95℃，变性时间超过40S时，检测到的DNA的量明显降低；变性时间小于20S时，容易出现假阴性。 结论：变性时间太短、变性温度太高且变性时间太长容易造成乙型肝炎病毒检测出假阴性。