MPTP诱导的帕金森病小鼠模型纹状体中Kir 2基因的表达

目的 研究1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠模型纹状体中Kir 2家族基因各亚型(Kir 2.1、Kir 2.2、Kir 2.3、Kir 2.4)mRNA的表达.方法 构建MPTP诱导的5d亚急性PD小鼠模型,按造模病程设定时间点提取小鼠纹状体总RNA,用Kir 2家族各亚型基因的特异性引物逆转录为cDNA,以荧光染料SYBR green Ⅰ进行荧光实时定量PCR(real-time PCR).检测各特定时间点Kir 2.1、Kir 2.2、Kir 2.3、Kir 2.4 mRNA表达.结果 对不同时间点模型样本的real-timePCR检测发现,Kir 2家族4种亚型基因在MPTP诱导的PD模型小鼠纹状体中均有不同程度表达,其中Kir 2.3和Kir2.4 mRNA随PD病程进展其表达量显著增加(P＜0.05).结论 PD发病机制与纹状体Kir 2家族Kit 2.3、Kir 2.4等亚型基因的表达可能有潜在联系.实验提示Kir 2具有作为潜在PD研究靶点的可能性.     

大鼠野生型钾通道亚基Kir2.3基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的：克隆大鼠野生型钾通道亚基基因Kir2.3并构建真核表达载体pcDNA3-flag/Kir2.3,观察其在大鼠嗜铬细胞瘤（PC12）细胞中的表达。方法：从成年大鼠纹状体中提取总RNA,用RT-PCR方法获得大鼠野生型Kir2.3基因的全长cDNA,经限制性内切酶双酶切后,克隆至真核表达载体pcDNA3-flag质粒中。Kir2.3基因测序结果与基因库登录序列比对,序列正确的重组质粒用脂质体转染PC12细胞,Western blot和荧光显微镜观察基因表达情况。结果：Kir2.3基因测序结果与基因库登录序列比对显示完全一致。Western blot证实pcDNA3-flag/Kir2.3转染PC12细胞24 h后有Kir2.3的过表达,且至少持续72 h。结论：成功构建了大鼠野生型Kir2.3基因的真核表达载体,获得了瞬时表达大鼠野生型Kir2.3基因的PC12细胞克隆,为进一步研究Kir2.3的生物学功能以及Kir2.3在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。     

MPTP诱导的帕金森病小鼠模型纹状体中Kir 2基因的表达

目的 研究1-甲基4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的帕金森病(PD)小鼠模型纹状体中Kir 2家族基因各亚型(Kir 2.1、Kir 2.2、Kir 2.3、Kir 2.4)mRNA的表达.方法 构建MPTP诱导的5d亚急性PD小鼠模型,按造模病程设定时间点提取小鼠纹状体总RNA,用Kir 2家族各亚型基因的特异性引物逆转录为cDNA,以荧光染料SYBR green Ⅰ进行荧光实时定量PCR(real-time PCR).检测各特定时间点Kir 2.1、Kir 2.2、Kir 2.3、Kir 2.4 mRNA表达.结果 对不同时间点模型样本的real-timePCR检测发现,Kir 2家族4种亚型基因在MPTP诱导的PD模型小鼠纹状体中均有不同程度表达,其中Kir 2.3和Kir2.4 mRNA随PD病程进展其表达量显著增加(P＜0.05).结论 PD发病机制与纹状体Kir 2家族Kit 2.3、Kir 2.4等亚型基因的表达可能有潜在联系.实验提示Kir 2具有作为潜在PD研究靶点的可能性.     

突触囊泡蛋白synaptotagmin XI的过表达对PCI2细胞和聚集小体形成的影响

目的构建突触囊泡蛋白synaptotagmin XI（SytXI）重组质粒，观察其在PCI2细胞中的表达，以及其对细胞和聚集小体形成的影响。方法运用人胚脑的cDNA文库作为模板，pcDNA3．1myc-His（-）B质粒作为载体，运用基因克隆技术构建重组质粒，限制性内切酶酶切，测序鉴定重组质粒；运用脂质体将重组质粒导入PCI2细胞，Annexin V-PI双染色和免疫荧光观察对细胞的影响。结果测序鉴定质粒构建成功，过表达SytXI导致细胞死亡，增加α-synuclein和vimentin阳性聚集小体的形成。结论成功构建SytXI重组表达质粒，过表达造成对PCI2细胞的毒性作用，并促进聚集小体的形成。     

突触囊泡蛋白synaptotagmin Ⅺ的过表达对PC12细胞和聚集小体形成的影响

目的 构建突触囊泡蛋白synaptotagmin Ⅺ(SytⅪ)重组质粒,观察其在PC12细胞中的表达,以及其对细胞和聚集小体形成的影响.方法 运用人胚脑的cDNA文库作为模板,pcDNA3.1myc-His(-)B质粒作为载体,运用基因克隆技术构建重组质粒,限制性内切酶酶切,测序鉴定重组质粒;运用脂质体将重组质粒导入PC12细胞,Annexin V-PI双染色和免疫荧光观察对细胞的影响.结果 测序鉴定质粒构建成功,过表达SytⅪ导致细胞死亡,增加α-synuclein和vimentin阳性聚集小体的形成.结论 成功构建SytⅪ重组表达质粒,过表达造成对PC12细胞的毒性作用,并促进聚集小体的形成.     

内向整流钾通道6.2亚基对鱼藤酮诱导PC12细胞毒性的调节作用及其相关信号通路的实验研究

目的:探讨ATP敏感性钾离子通道亚基内向整流钾通道(Kir)6.2过表达对鱼藤酮诱导的大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞毒性作用的调节作用及其相关信号通路。方法:转染Kir6.2质粒于PC12细胞48 h后,分别采用细胞免疫荧光和Western blot方法观察Kir6.2的表达,然后用水溶性四氮唑盐(WST-1)法检测3组细胞(正常对照组、转染组、空载体组)在500 nmol/L鱼藤酮处理24 h后的细胞活力;Western blot检测胞内蛋白激酶C(PKC)及磷酸化PKC(p-PKC)的变化。结果:细胞免疫荧光及Western blot结果显示转染组Kir6.2在细胞中表达较正常组和空载体组明显增高,WST-1检测发现转染组细胞活力较其他2组增高(P<0.05)。在Kir6.2过表达的PC12细胞中,p-PKC的活性上调,且不被PKC抑制剂所抑制。结论:Kir6.2过表达可拮抗鱼藤酮诱导的PC12细胞毒性,且这一神经保护作用与PKC信号通路相关,尤其是p-PKC。