重组人bFGF的原核表达及其高效价抗血清的制备

目的 以重组人碱性成纤维生长因子为免疫原，制备高效价抗hbFGF抗血清。方法通过PCR方法改造5’编码区的12个密码子，构建hbFGF’原核表达载体并在大肠杆菌(E．coli)中表达，以纯化的hbFGF、免疫新西兰兔，制备高效价抗血清，用于重组hbFGF、的免疫印迹分析。结果经过改造的hbFGF基因在E．coli中获得较高水平表达。从可溶性部分纯化得到纯度95％以上的重组hbFGF，以该重组蛋白免疫兔子，在二次加强后以间接ELISA检测抗血清效价可达1：512000。免疫印迹分析显示该抗血清与E．coli中表达的重组hbFGF、和标准hbFGF、均有特异性反应，但与某些细菌蛋白存在弱交叉反应，经E．coli菌体蛋白吸附的抗血清，与菌体蛋白的弱交叉反应消失。结论以纯化的重组hbFGF为免疫原制备了高效价的特异性抗血清，经菌体蛋白吸附可消除存在的交叉反应性。     

重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料的骨诱导活性

背景：已有将重组人骨形态发生蛋白2应用于骨再生及修复的报道,但由于其在生物体内半衰期短而导致诱导骨形成的能力受到限制。目的：制备具有较好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,并检测其缓释性能及骨诱导活性。方法：通过高效液相色谱法检测重组人骨形态发生蛋白2-肝素复合物对于酶解的保护作用。将重组人骨形态发生蛋白2与肝素溶液混匀后复合于人工骨材料表面,ELISA方法检测其体外释药性质,茜素红染色法检测其诱导成骨细胞的能力,应用小鼠体内实验评价其异位骨诱导能力。结果与结论：成功制备了具有良好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,具有较强的诱导骨钙蛋白及异位骨形成能力。     

利用双顺反子系统在大肠杆菌中高表达bFGF

目的:由于人碱性成纤维细胞生长因子编码基因结构存在不利于原核表达的因素,构建了双顺反子的大肠杆菌表达系统,以期提高其表达量。方法:其中质粒表达载体pET-3c携带的T7噬菌体10基因N端氨基酸的编码序列为第一个顺反子,bFGF编码基因为第二个顺反子,二者同处于T7启动子的下游。结果:将重组子转导表达菌BL21(DE3),并经IPTG诱导表达,表达量达到菌体总蛋白的20%,并具有良好的活性。结论:证明双顺反子系统可以有效增加bFGF的表达量。     

重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料的骨诱导活性

背景：已有将重组人骨形态发生蛋白2应用于骨再生及修复的报道,但由于其在生物体内半衰期短而导致诱导骨形成的能力受到限制。 目的：制备具有较好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,并检测其缓释性能及骨诱导活性。 方法：通过高效液相色谱法检测重组人骨形态发生蛋白2-肝素复合物对于酶解的保护作用。将重组人骨形态发生蛋白2与肝素溶液混匀后复合于人工骨材料表面,ELISA方法检测其体外释药性质,茜素红染色法检测其诱导成骨细胞的能力,应用小鼠体内实验评价其异位骨诱导能力。 结果与结论：成功制备了具有良好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,具有较强的诱导骨钙蛋白及异位骨形成能力。     

缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导骨形成

背景：重组人骨形态发生蛋白2在体内半衰期短、易降解代谢,达不到理想的骨再生效果。 目的：制备缓释型重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料,并观察其缓释性能、骨诱导活性。 方法：将重组人骨形态发生蛋白2与壳聚糖混合制备壳聚糖膜,涂覆于生物骨修复材料表面,ELISA方法检测其体外释药性能。茜素红染色检测缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料、单纯骨填充材料诱导C2C12细胞骨钙蛋白的形成,观察其诱导成骨细胞能力。同时将3种骨修复材料植入清洁级KM小鼠股部肌袋内,2周后检测新生骨Ca2+离子含量,评价其异位骨诱导能力。 结果与结论：材料表面的壳聚糖膜分布均匀,负载的重组人骨形态发生蛋白2呈团簇状。重组人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料体外释药存在突释,前4 d释放量达总药量的50%,持续至12 d,释药量达到90%,第18天时释放完全。与单纯骨填充材料、重组人骨形态发生蛋白2生物骨材料相比,缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料诱导C2C12细胞向成骨晚期分化能力与异位骨形成能力显著增强(P < 0.05)。结果提示缓释型人骨形态发生蛋白2/壳聚糖生物骨修复材料缓释性能好,促进骨形成能力强。     

重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料的骨诱导活性

背景：已有将重组人骨形态发生蛋白2应用于骨再生及修复的报道,但由于其在生物体内半衰期短而导致诱导骨形成的能力受到限制。 目的：制备具有较好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,并检测其缓释性能及骨诱导活性。 方法：通过高效液相色谱法检测重组人骨形态发生蛋白2-肝素复合物对于酶解的保护作用。将重组人骨形态发生蛋白2与肝素溶液混匀后复合于人工骨材料表面,ELISA方法检测其体外释药性质,茜素红染色法检测其诱导成骨细胞的能力,应用小鼠体内实验评价其异位骨诱导能力。 结果与结论：成功制备了具有良好缓释效果的重组人骨形态发生蛋白2-肝素-人工骨复合材料,具有较强的诱导骨钙蛋白及异位骨形成能力。     

透明质酸钠复合重组人骨形态发生蛋白2注射剂对下颌骨量的扩增作用

背景:对牙槽骨骨量需要扩增的患者而言,固态的支架材料并不太适用.寻找具有流动性和黏附能力、不占体积的材料是目前研究热点.目的:观察透明质酸钠(sodium hyaluronate,SH)复合重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein,rhBMP-2)注射剂对兔下颌骨量的扩增作用.方法:60只兔按随机区组设计分为4组:rhBMP-2-SH组、rhBMP-2组、SH组分别于双侧下颌骨膜下置入rhBMP-2-SH复合物0.2 mL、rhBMP-2 0.5 mg、SH 0.2 mL.空白对照组双侧均切开后不作处理即关闭伤口.术后第2,4,8周分批处死动物.处死前作 ~(99)Tc~m-MDP骨显像;处死后切取标本作苏木精一伊红染色观察、胶原I免疫组化、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量检测.结果与结论:①rhBMP-2-SH组 ~(99)Tc~m-MDP骨显像下颌骨感兴趣区计数比值于2,8周时高于其他各组(P<0.05),4周时明显高于其他各组(P<0.01)..②组织学观察rhBMP-2-SH组于术后2周即有新生骨小梁生成,至8周钙化成板层骨块,并且4周时可见透明软骨细胞出现,胶原I免疫组化只在2周骨基质中呈强阳性表达.③rhBMP-2-SH组碱性磷酸酶活性指数明显高于其他各组(P<0.01);并随着时间延长而逐渐增高(P<0.01).④rhBMP-2-SH组骨钙素含量于4周及8周时明显高于其他各组(P<0.01),并随着时间延长而逐渐增高(P<0.01).提示rhBMP-2-SH注射剂能于兔下颌骨表面稳定地形成新骨从而达到骨量扩增效应.成骨方式为混合型成骨方式,以膜内成骨为主.     

一种有效分离人尿激肽释放酶和人尿胰蛋白酶抑制剂的方法

人尿激肽释放酶和人尿胰蛋白酶抑制剂是存在于尿中的酸性蛋白.本文通过ZnCl2胶体沉淀和乙醇沉淀相结合的方法可有效分离两者,得率高、活性保留好.     

P253R突变型FGFR2Ⅲc胞外段的表达、复性及活性研究(英文)

成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)具有促进细胞增殖,诱导新生血管形成等重要生理作用,与肿瘤的发生及发展也有十分密切的关系。P253R是Apert综合症中发现的一种突变,可使FGFR2IIIc与FGF2亲和力大大增加,从而导致过度自分泌和旁分泌活性,引起骨骼发育异常。从人胎盘组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增得到野生型FGFR2IIIc胞外段基因片段(wsFGFR2);再利用重叠延伸法以wsFGFR2基因片段为模板扩增得到P253R突变型FGFR2IIIc胞外段基因片段(msFGFR2,P253R是Apert综合征中发现的一种突变,可使FGFR2与FGF2亲和力大大增加)。msFGFR2基因克隆到pET3c载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式表达。经凝胶层析复性和肝素亲和层析纯化得到复性成功的活性蛋白,复性率为12%,纯度大于95%。MTT结果表明,msFGFR2能显著抑制FGF2促NIH3T3细胞增殖能力,并抑制前列腺癌DU145细胞的增殖,提示msFGFR2能有效阻断FGFs的细胞内信号通路,具有很好的产业化和临床应用前景。     

重组人骨形成蛋白-2提高人乳腺癌细胞MCF-7的迁移性

目的:探讨重组人骨形成蛋白-2(rhBMP2)对人乳腺癌细胞MCF-7迁移性的影响。方法:用rhBMP2诱导人乳腺癌细胞MCF-7,并利用原子力显微镜观察细胞的形态结构变化。通过划痕愈合和transwell实验研究rhBMP2诱导下人乳腺癌细胞MCF-7迁移能力的变化。结果:rhBMP2诱导组的细胞形态产生变化,多数细胞伸出板状伪足产生极性,细胞长度变长;相反,对照组细胞的伪足不明显,多数细胞趋于圆形,细胞直径短。划痕愈合和transwell实验显示,与对照组相比,rhBMP2诱导的MCF-7细胞的迁移和侵入能力明显加强。结论:rhBMP2能够诱导人乳腺癌细胞MCF-7获得迁移表型,并提高了MCF-7细胞的迁移和侵入能力。