蛋白质不稳定性及其分析技术

蛋白质不稳定性包括两种形式：化学不稳定性和物理不稳定性，这两种不稳定性可采取不同的分析技术。了解蛋白质不稳定性及其分析技术在生物工程药物的质量控制中有十分重要的作用。     

5 L生物反应器中长期灌流培养CHO工程细胞生产rt-PA

目的 :利用 5L反应器培养CHO工程细胞生产重组组织型纤溶酶原激活剂 (recombinanttissueplasminogenactivator ,rt PA)。 方法 :在 5L搅拌式生物反应器中采用Cytopore1多孔微载体和无血清培基DF5S连续灌流培养CHO工程细胞株 4B3。结果 :持续培养达 10 3d ,活细胞密度和rt PA生产水平分别达到 6 .52× 10 6 个细胞 /ml和 1716 1U/ml。细胞培养上清经StreamlineSP离子交换层析和Lysine Sepharose 4B亲和层析两步纯化 ,获得纯度达到 98%的rt PA。SDS PAGE分析表明 ,整个培养过程所生产的rt PA具有较好的质量一致性。产品热原检测合格。结论 :实现高密度长期培养 4B3细胞 ,确定 5L培养工艺 ,为进一步扩大生产规模奠定了基础     

损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的作用

背景：损伤胰腺提取液含有胰腺再生过程的特异性生长因子，能够促进β细胞系增殖和胰岛素分泌，可能有助于胰岛再生和细胞分化。 目的：观察损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2005-06/2007-03在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。 材料：清洁级雄性Sprague-Dawley大鼠6只，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。活化素A、视黄酸、胰蛋白酶抑制剂为Sigma公司产品，链脲菌素为Sigma公司产品。 方法：大鼠腹腔注射链脲菌素，2 d后血糖浓度超过10 mmol/L时取其胰腺组织，在含有胰蛋白抑制剂的磷酸盐缓冲液中制备匀浆，2次离心后取上清，即为损伤胰腺提取液。采用密度梯度离心法分离大鼠骨髓间充质干细胞，当传代细胞生长至70%~80%融合时，随机分为4组：对照组以体积分数为0.02的胎牛血清的低糖DMEM培养11 d；活化素A+视黄酸组以活化素A、视黄酸各自诱导24 h，再以碱性成纤维生长因子、尼克酰胺、尼克酰胺+exendin 4各自诱导3 d；活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组在前组基础上添加损伤胰腺提取液；损伤胰腺提取液组单纯以损伤胰腺提取液诱导11 d。 主要观察指标：应用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应等方法对分化细胞表型进行检测，ELISA法检测细胞胰岛素的分泌水平。 结果：活化素A+视黄酸组、活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组有较多的胰岛素阳性反应细胞出现，且后者形成的胰岛样结构较前者大而多；损伤胰腺提取液组可见较少的胰岛素阳性反应细胞及胰岛样结构。各诱导组均检测到胰岛素1 mRNA的表达，培养上清中均可检测到胰岛素的分泌，且活化素A+视黄酸+损伤胰腺提取液组胰岛素分泌水平>活化素A+视黄酸组>损伤胰腺提取液组（P < 0.05）。对照组各项指标均呈阴性表达。 结论：基于前期活化素A、视黄酸及其他成熟因子的诱导方案基础上，损伤胰腺提取液对骨髓间充质干细胞分化为胰岛样细胞具有促进作用，能够提高诱导分化效率。     

羊水多潜能干细胞的体外培养及其生物学特性

背景：近来发现羊水中含有具有多向分化潜能的干细胞，具有向内胚层、中胚层和外胚层分化的能力。目的：建立羊水多潜能干细胞的体外培养方法，并探讨其生物学特性。设计、时间及地点：单一样本实验，于2007—04／2008—01在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。材料：5份羊水标本来自孕16～22周流产孕妇自愿捐献。方法：从人孕中期羊水中，采用贴壁筛选法分离羊水多潜能干细胞。主要观察指标：采用免疫荧光、流式细胞术和反转录聚合酶链反应等方法分析细胞的生物学特性和鉴定细胞表型。结果：体外培养的羊水多潜能干细胞呈梭形或类上皮细胞样，细胞增殖迅速，细胞倍增时间约为24h，细胞周期中G1、S、G2期的细胞所占百分比分别为72．88％、5．77％、21．35％；细胞表达Oct4、Nanog、SSEA-4、CD44和CD105，不表达CD34和CD45。结论：采用贴壁筛选法获得的羊水多潜能干细胞增殖能力强，同时表达胚胎和成体干细胞的部分标志，可能为介于胚胎干细胞与成体干细胞之间的一种过渡阶段的干细胞。     

u-PA在细胞培养上清中的稳定性

尿激酶型纤溶酶原激活剂 (u_PA)主要是由无酶催化活性的单链酶原 (scu_PA或pro_UK)和具有激活纤溶酶原 (plas minogen)活性的双链尿激酶 (tcu_PA或UK)组成。scu_PA只激活吸附在纤维蛋白表面的纤溶酶原 ,具有选择性溶栓作用[1] 。scu_PA由 411个氨基酸组成 ,可被体内纤溶酶或激肽释放酶催化在Lys15 8～Ile15 9之间的肽键水解断裂转换为双链尿激酶。我所已构建了表达水平为 5 μg/ (10 6细胞·d)的基因重组CHO工程细胞株用于生产u_PA[2 ] ,并已放大至30L培养规模 ,采用多孔微载体无血清连续培养工艺 ,培养上清中u_PA的最高浓度可达 …     

活化素A和视黄酸诱导骨髓间充质干细胞体外分化为胰岛素分泌细胞

背景：胰岛移植是治疗Ⅰ型糖尿病的最有效的方法。然而，供体组织来源的匮乏限制了其应用。近来干细胞研究的进展表明，干细胞疗法可能解决这一问题。 目的：采用活化素A和视黄酸诱导骨髓间充质干细胞分化，探讨骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的可能性。 设计：随机对照实验。单位：解放军军事医学科学院生物工程研究所。材料：实验于2004-11／2005-06在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。Sprague-Dawley大鼠6只，雄性，体质量150-160g，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。 方法：无菌抽取大鼠股骨骨髓，采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞。传代细胞随机分为4组，高糖组、活化素A和视黄酸组、β-巯基乙醇组和阴性对照组。分别采用含有高糖、活化素A和视黄酸、β-巯基乙醇等刺激因素的条件培养基进行诱导。应用免疫细胞化学和反转录聚合酶链反应等方法对分化细胞表型进行检测。 主要观察指标：检测胰岛素和胰高血糖素，以及胰岛素1mRNA的表达。 结果：骨髓间充质千细胞经过诱导后，①在高糖诱导组中，有散在的胰岛素和胰高血糖素阳性反应细胞出现。②活化素A和视黄酸组及β-巯基乙醇组有较多的胰岛素和胰高血糖素阳性反应细胞出现，而且这些细胞形成类似胰岛样的结构。③高糖组，活化素A和视黄酸组，β-巯基乙醇组均可见胰岛素lmRNA的表达。④阴性对照组未见有胰岛素和胰高血糖素阳性反应细胞出现以及胰岛素1mRNA的表达。 结论：实验建立的一种基于活化素A和视黄酸及其他成熟因子的一种诱导方案，成功将骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛素阳性反应细胞，并且形成类似胰岛样结构，但其诱导效率有待进一步提高。     

重组人尿型纤溶酶原激活剂规模生产中纯化过程的质量控制

尿型纤溶酶原激活剂(u-PA)是一种高效、出血副作用和再阻率低的溶栓制剂,由于在溶液中不稳定,在纤溶酶、激肽释放酶、胰酶及理化因素影响下,容易从158Lye-159Ile处断裂成双链,故u-PA有包括单链和双链两种形态.u-PA的国外临床用量最大剂量可达80 mg,因此对产品的质量提出更高的要求.为了保证产品的最终质量,必须在生产过程中加以严格控制,以确保产品的安全有效.我们对u-PA中试生产中纯化阶段的质量控制进行了研究,包括:蛋白含量、活性测定、活性回收率及比活计算、单双链比例测定、纯度分析几项指标的控制,以保证产品的质量.     

发色底物法定量测定重组u-PA产品的总活性和单链比例

目的建立一种发色底物酶水解方法定量分析重组尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)中的总活性及其单链酶原比例.方法用嗜热菌蛋白酶激活u-PA转化成具有催化活性的双链尿激酶,再用尿激酶的发色底物S-2444测定u-PA的总活性.在非激活条件下,u-PA产品中的单链酶原不会催化水解S-2444底物,因而可以测定其单链酶原比例.结果优化了嗜热菌蛋白酶激活u-PA的反应条件和尿激酶催化水解S-2444的反应条件.用这种方法测定了用CHO细胞表达的基因重组u-PA产品,单链比例大于98%,比活性约为11×104 U/mg.结论用发色底物法测定重组人u-PA产品中的总活性和单链比例具有很好的重复性和准确性.     

不稳定蛋白质的分离纯化

随着生物技术的发展，制备高纯度和活性的药物和研究用蛋白质越来越重要，在分离纯化中，特别是不稳定蛋白的分离纯化，需要控制影响蛋白质稳定性的因素和采用分离纯化新技术，以确保目标蛋白的纯度的高活性。     

羊水多潜能干细胞的体外培养及其生物学特性

背景：近来发现羊水中含有具有多向分化潜能的干细胞，具有向内胚层、中胚层和外胚层分化的能力。 目的：建立羊水多潜能干细胞的体外培养方法，并探讨其生物学特性。 设计、时间及地点：单一样本实验，于2007-04/2008-01在解放军军事医学科学院生物工程研究所完成。 材料：5份羊水标本来自孕16~22周流产孕妇自愿捐献。 方法：从人孕中期羊水中，采用贴壁筛选法分离羊水多潜能干细胞。 主要观察指标：采用免疫荧光、流式细胞术和反转录聚合酶链反应等方法分析细胞的生物学特性和鉴定细胞表型。 结果：体外培养的羊水多潜能干细胞呈梭形或类上皮细胞样，细胞增殖迅速，细胞倍增时间约为24h；细胞周期中G1、S、G2期的细胞所占百分比分别为72.88%、5.77%、21.35%；细胞表达Oct4、Nanog、SSEA-4、CD44和CD105，不表达CD34和CD45。 结论：采用贴壁筛选法获得的羊水多潜能干细胞增殖能力强，同时表达胚胎和成体干细胞的部分标志，可能为介于胚胎干细胞与成体干细胞之间的一种过渡阶段的干细胞。