水牛体外受精胚胎的玻璃化冷冻

本文以ES35为玻璃化冷冻液 ,ES2 0和 30 %乙二醇为前处理液 ,进行不同时间的前处理 ,初步探讨了水牛体外受精胚胎的玻璃化冷冻保存方法。结果 4个处理组中以ES2 0前处理 2min组冷冻效果最好 ,其冻胚解冻后孵化率达 6 4 .4 1% ,30 %乙二醇前处理 5min组孵化率为 5 7.4 1% ,两组与对照组差异不显著 ,其余两组与对照组差异极显著 ;ES2 0前处理中 2min组与 5min组差异极显著 (6 4 .4 1%vs2 1.15 % ,P <0 .0 1) ;30 %乙二醇前处理中 5min组极显著高于 2min组 (5 7.4 1%vs2 3.6 4 % ,P <0 .0 1) ;取ES2 0前处理 2min组的冻胚移植了 5头本地母水牛 ,结果有一头妊娠。于 2 0 0 2年 12月 6日产下全国首例冻胚移植的试管水牛     

添加β-巯基乙醇对水牛胚胎体外发育的影响

本文主要研究低分子量的硫醇类化合物－β－硫基乙醇（β－ME）对水牛胚胎体外发育的影响。通过在水牛的体外成熟,受精后胚胎的体外发育过程中分别添加50和100μM的β－ME,来检测β－ME的添加对水牛受精卵的分裂率和植入前胚胎体外发育的影响。结果表明,对照组（0μM)与实验组（50和100μM)相比,48h受精分裂率（分别为45．88％,46．38％和50．67％）差异不显著（P＞0．05）,但囊胚率（分别为8．97％,26．61％和26．55％）差异极显著（P＜0．01）,而孵化囊胚率（分别为80．0％,90．48％和83．33％）差异不显著（P＞0．05）,在两个实验组（50和100μM）之间分裂率,囊胚率以及孵化囊胚率均为差异不显著（P＞0．05）。结果表明在体外培养条件下添加一定浓度的β－ME可以显著促进更多的分裂后水牛早期胚胎发育至囊胚胎发育至囊胚阶段,但对于囊胚向孵化胚发育过渡却没有显著影响。     

人骨髓基质细胞核移植重构胚的建立

目的建立人体细胞核移植技术，为治疗性克隆的实验研究及临床应用奠定基础。方法应用显微操作技术将单个人骨髓基质细胞注入去核后的兔卵母细胞内，经电融合、离子霉素和6．甲氨基嘌呤激活后．培养于含10％胎牛血清的TCM-199中，使重构胚进一步发育至囊胚。结果245枚卵母细胞进行去注核显微操作，核移植后有72．6％（178／245）卵母细胞仍保持完整；经电融合后细胞融合率为62．8％（83／132）：体外培养后约65％（54／83）的重构胚可进入分裂期，3．7％（2／54）发育至桑囊期，囊胚孵化率为100％（2／2）。结论兔卵母细胞能使人骨髓基质细胞核重新编程形成核移植重构胚并可继续发育至囊胚，使得从核移植重构囊胚分离胚胎干细胞用于实验和临床治疗研究成为可能。     

兔卵母细胞孤雌激活及不同添加物对激活胚胎发育的影响

目的 探寻一种稳定有效的卵母细胞激活方法及体外培养体系,为下一步的治疗性克隆胚激活及培养实验提供相关参照. 方法 (1)选取具有第一极体的成熟兔卵母细胞随机分组,比较1.2 kV/cm、1.6 kV/cm、2.0 kV/cm场强的电激活及5μg/mL离子霉素(ION)激活对兔卵母细胞孤雌激活效果;(2)激活处理后的卵母细胞,分别在添加0、10、20、40、80 ng/mL白血病抑制因子(LIF)及添加0、1×、2×胰岛素、转铁蛋白、硒化钠复合物(ITS)的M199液中培养,比较孤雌胚胎的卵裂率、8-16细胞胚胎比例、桑囊率以及囊胚细胞总数情况. 结果 (1)不同激活方式对兔卵母细胞的激活效果差异较大.ION处理组存活率高于2.0 kV/cm电激活处理组,差异有统计学意义(P＜0.05);而在分裂率、8-16细胞率、桑囊率上,ION处理组高于1.2 kV/cm电激活处理组,差异有统计学意义(P＜0.05).(2) 20 ng/mL LIF组桑囊率高于80 ng/mL LIF组,差异有统计学意义(P＜0.05).在囊胚细胞总数上,20 ng/mL LIF组高于40 ng/mL LIF和80 ng/mL LIF组,差异有统计学意义(P＜0.05).1×ITS组的桑囊率高于2×ITS组,差异有统计学意义(P＜0.05).此外,0×ITS组及1×ITS组的囊胚细胞总数分别为166.00枚、147.40枚,多于2×ITS组(78.00枚),差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 ION处理激活新西兰大白兔卵母细胞能获得较好的分裂率和囊胚率;添加20 ng/mL LIF、1 ×ITS可以促进兔孤雌激活胚胎的后期发育.     

兔骨髓基质细胞核移植的初步研究

目的 通过建立骨髓基质细胞核移植的方法，为进一步从克隆囊胚的内细胞团细胞分离培养出全能性的胚胎干细胞并用于治疗性克隆等研究奠定基础。方法 超排获得的兔成熟卵母细胞去核后，将同种的单个骨髓基质细胞核注入其内；电融合后，经离子霉素（ionomycin）和6-甲氨基嘌呤（6-DMAP）激活，用10％胎牛血清（FBS）的TCM-199进行体外培养直至囊胚阶段。结果 实验对147个卵母细胞去核，去核成功率为70．75％（104／147）；注核后有82．69％（86／104）的卵细胞保持形态完整；重构后的体细胞-卵母细胞质复合体经电融合后的融合率为56．79％（46／81）；激活后的重构胚于体外培养后分裂率为65．22％（30／46），囊胚率为17．39％（8／46），获得的囊胚有62．5％（5／8）进入孵化阶段；孵化出来的细胞贴壁生长并向周围扩展，显示了具有向下一阶段发育的潜能，为从囊胚内细胞团细胞中分离并培养出胚胎干细胞提供了可能。结论 实验结果表明，以兔成体体细胞的骨髓基质细胞为核供体，经克隆技术生产出囊胚并从中分离内细胞团细胞具有可行性。     

人骨髓基质细胞作为核移植供体细胞的相关生物学特性研究

目的研究作为核移植供体细胞的人骨髓基质细胞相关生物学特性。方法应用密度梯度离心法分离培养人骨髓基质细胞，并对其进行形态观察、免疫荧光分析细胞骨架结构、端粒酶活性测定、核型及细胞周期分析。结果培养的细胞具有正常的大小、形态、细胞骨架结构：在融合密度达80%-90%时，G0＋G1期细胞所占的比例较高，约占92．58％；检测传至第7代的人骨髓基质细胞具有正常染色体数目（46，XY），端粒酶活性为0．567。结论形态良好、染色体数目正常的人骨髓基质细胞可以作为核移植的供体细胞。