人跨膜蛋白39A原核表达载体构建、条件优化及可溶性表达

目的构建人跨膜蛋白39A基因(TMEM39A)的原核表达载体,优化表达条件并获得可溶性表达的TMEM39A。方法以HEK293细胞的总RNA为模板,反转录PCR扩增TMEM39A,构建其原核表达载体pGEX-6P-1-TMEM39A,并在不同温度、IPTG浓度、A_(600nm)值及时间条件进行诱导表达,然后利用上述获得的最佳诱导条件进行大量表达,分析其可溶性和抗原性。结果重组表达载体pGEX-6P-1-TMEM39A与GenBank中的TMEM39A(登录号:BC021277.2)的核苷酸序列同源性为99.9%,氨基酸序列同源性为100%。重组蛋白GST-TMEM39A在69和60 ku处出现两条特异性条带,采用单因素方法对不同温度、IPTG浓度、A_(600nm)值及时间进行分析得出GST-TMEM39A的最佳诱导条件为25℃、A_(600nm)值为0.6～0.8、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导9 h;在此基础上进行大量表达,并以可溶性形式获得了TMEM39A与GST蛋白的融合表达。结论成功构建了TMEM39A的原核表达载体,确定了GST-TMEM39A的最佳表达条件并实现其的可溶性表达,为后续纯化TMEM39A、制备抗体开展功能研究奠定物质基础,并为深入探讨TMEM39A与许多疾病或病毒的关系提供科学依据。     

新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性

背景：现已证实,人肌腱、牛肌腱、鼠尾、猪皮、新生牛跟腱制备的胶原蛋白海绵有良好的细胞相容性。目的：采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其与羔羊肾成纤维细胞的相容性。设计、时间及地点：对比观察实验,于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。材料：出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮,岷县黑裘皮羔羊肾原代成纤维细胞。方法：取新生牛犊皮,经脱毛、胃蛋白酶＋冰醋酸联合处理、盐析、透析、冻干后制备胶原蛋白海绵。将海绵与羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（橡胶塞浸提液）。主要观察指标：应用倒置相差显微镜及JVC数码摄像系统观察、拍摄与记录细胞形态、生长情况。培养20,35d,对共培养物进行AO染色,观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色,观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果：阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。AO染色显示培养20,35d的胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论：制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的相容性。     

兰州市猪戊型肝炎血清学及病毒基因型分析

目的 调查甘肃省兰州市猪戊型肝炎病毒(HEV)感染情况以及基因型.方法 收集兰州市部分地区猪血清,用ELISA诊断试剂盒分别检测HEV抗原和抗体;其中抗原阳性的血清,采用HEV ORF2引物进行套式逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)扩增,对阳性扩增产物进行克隆和测序,并对序列进行分析,确定其基因型.结果 3月以下猪戊型肝炎病毒抗原、抗体阳性率分别为1.56%和90.27%,3个月以上分别为2.35%和86.99%,抗原、抗体水平在3月龄以上和以下二者中差异无统计学意义,抗原阳性血清共有22份,其中7份为HEV核酸阳性,其核苷酸序列与HEV 4型的同源性为82.2%～99.3%,分别为4a,4d和4f亚型.结论 兰州市猪群存在HEV感染,且为基因4型.     

新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性

目的:采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其生物学活性与细胞相容性。方法:实验于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。实验方法:①取出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮制备胶原蛋白海绵。②将新生牛皮胶原蛋白海绵与黑裘皮羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(橡胶塞浸提液)。实验评估:①应用倒置相差显微镜观察细胞形态。②培养20,35d对细胞与胶原蛋白海绵共培养物进行AO染色观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。③培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果:①细胞形态观察结果:阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。②细胞在胶原海绵中的增殖情况:吖啶橙-AO染色显示培养20,35d胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。③细胞在胶原海绵中的生长情况:苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论:制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的生物相容性,无细胞毒性。     

新生牛跟腱胶原蛋白海绵与动物肾、睾丸、皮肤细胞的生物相容性

背景：随着新生牛血清的产业化，新生牛跟腱资源大量积累，使得利用其制备医用胶原蛋白海绵并产业化成为可能。 目的：采用新生牛跟腱制备胶原蛋白海绵，观察其与Vero 细胞、天祝白牦牛胚胎皮肤细胞和岷县黑紫羔羊睾丸细胞的生物相容性。 设计、时间、地点：重复测量观察，于2006- 02/05 在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。 材料：用出生24 h内的新生牛跟腱经冰醋酸、胃蛋白酶等消化, 经盐析、透析及冻干等处理后，制成胶原蛋白海绵。天祝白牦牛胚胎皮肤f2代细胞和岷县黑紫羔羊睾丸f2代细胞为自制，Vero 细胞为协和医科大学细胞中心提供。 方法：在6孔板中, 将3种细胞分别接种于经紫外线、臭氧灭菌后的胶原蛋白海绵上，于37 ℃、 体积分数为0.05 的CO2 恒温箱培养，同时设对照实验。 主要观察指标：相差显微镜观察接种5，12，24，72 h时 3种细胞在胶原蛋白海绵上和6孔板底的生长情况，接种11 d对共培养物行考马斯亮蓝、苏木精-伊红染色。 结果：接种后5 h, 在胶原蛋白海绵周围的6孔板底部可看到细胞已贴壁、伸展, 个别细胞有分裂现象, 在胶原蛋白海绵表面, 隐约可见圆形细胞排列。接种后48~72 h 时, 6孔板底部细胞铺满单层。接种后11 d，考马斯亮蓝和苏木精-伊红染色显示3 种共培养物中均有大量细胞良好生长, 胶原海绵外观变得挺拔、透明、有韧性。 结论：新生牛跟腱胶原蛋白海绵与上述3种来自不同动物、不同组织的细胞有很好的生物相容性，可做皮肤细胞、肾细胞和睾丸细胞的培养支架。     

VCAM-1与VLA-4相互作用与肿瘤关系的研究进展

晚期抗原4(VLA-4)与血管细胞黏附分子1(VCAM-1)互为配体,VLA-4能与VCAM-1的第1结构域或第4结构域的特异性结合。在VCAM-1的结构域1和结构域4中发现的6个线性氨基酸序列对两者的特异性结合起着至关重要的作用。VLA-4和VCAM-1在多种疾病中都高表达并与许多疾病的发病机制有着密不可分的联系。     

人脑心肌炎病毒免疫球蛋白M捕获酶联免疫吸附试验的建立及初步应用

目的建立脑心肌炎病毒(EMCV)免疫球蛋白M(IgM)捕获酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,用于感染EMCV血清学早期诊断。方法用抗人IgM(μ链)单抗进行包被,辣根过氧化物酶(HRP)标记的EMCV为酶标抗原,初步建立EMCV IgM捕获ELISA;对建立的方法进行条件优化及特异性、精密性、稳定性等验证。结果建立的EMCV IgM捕获ELISA检测方法抗体包被浓度为1μg/mL,EMCV-HRP工作浓度和反应时间分别为1∶400和45min,封闭液为10%马血清时该法检测效果可达最佳,3批试剂批内及批间变异系数均小于5%,且特异性、精密性及稳定性较好。结论建立的EMCV IgM捕获ELISA法特异、精密且稳定,可用于人感染EMCV的早期检查,为EMCV的诊断奠定基础。     

药学仪器分析理论开放式教学模式探索

提出仪器分析理论的开放式教学模式,通过观摩教学、现场实验教学方式,发挥学生作为学习主体的能动性,激发学生的学习兴趣,培养学生的思维能力和动手能力。