hape反义核酸的构建及其对细胞辐射效应的影响

目的克隆人ＡＰ内切核酸酶基因（ｈａｐｅ）ｃＤＮＡ全长编码序列,研究ｈａｐｅ反义核酸对细胞辐射敏感性和Ｈ２Ｏ２细胞毒的影响。方法反转录ＰＣＲ克隆人ｈａｐｅｃＤＮＡ,应用基因重组技术构建真核反义表达载体,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ介导基因转染,细胞克隆形成法分析细胞存活。结果从人胚肺（ＨＥＬ）细胞中克隆出ｈａｐｅｃＤＮＡ全长编码序列,构建了ｈａｐｅ的真核反义表达质粒ｐＣＩＮ／ＡＳｈａｐｅ并转染ＨＯＣ８细胞,研究表明ｈａｐｅ反义核酸,提高了ＨＯＣ８细胞对γ射线和Ｈ２Ｏ２损伤的敏感性。结论利用分子生物学技术手段,阻断细胞ＤＮＡ修复过程中的某一环节,是细胞辐射或化疗药物增敏的一种有效途径。     

利用人支气管上皮细胞系分离和培养人博卡病毒

目的 研究人博卡病毒(HBoV)在呼吸道感染中致病性及机理.方法 利用人支气管上皮细胞系进行HBoV分离及培养,通过电镜对培养细胞中HBoV的形态及感染细胞进行研究,并采用逆转录PCR(RT-PCR)方法,检测HBoV在细胞中转录产物mRNA,同时对扩增产物进行测序及分析.结果 将含有HBoV阳性痰液标本无菌接种人支气管上皮细胞系,出现2例致使细胞发生明显的病变(CPE).电镜观察在细胞质中散在六角形或圆形的病毒粒子,大小18～26 nm之间,大部分是20nm.RT-PCR扩增产物经电泳检测与预期结果相符是295 bp,扩增产物测序结果与GenBank中HBoV序列比较,核苷酸同缘性99%,氨基酸同缘性100%.结论 HBoV感染人支气管上皮细胞后能够在该细胞内增殖,并产生特征性生物学改变.本研究为今后HBoV致病性及免疫应答谱研究奠定基础.     

实时荧光定量PCR检测儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒

目的 建立并应用检测儿童下呼吸道感染WU多瘤病毒(WU polyomavirus)的实时荧光定量PCR( real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)方法.方法 选择WU多瘤病毒的VP2基因作为检测的目标基因,设计FQ-PCR引物和检测探针,以重组质粒为标准品建立标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价;应用该方法对温州医学院附属温岭医院收集的临床下呼吸道感染患儿的痰液、咽拭子846份及血清标本846份进行定量检测.结果 本研究建立FQ-PCR检测方法,质粒标准曲线的方差系数为0.998,灵敏度可达到50拷贝;应用该方法检测700份痰液标本,检测到7例阳性标本,146份咽试子标本中未检测到阳性标本,总阳性率为1.00％ (7/700),846份血清标本未检测到阳性标本.结论 本研究建立的FQ-PCR方法可以特异、快速、灵敏地对儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒进行定量检测;痰液标本较咽拭子或血清标本更适用于WU多瘤病毒感染的核酸检测.     

基因芯片检测拉米夫定治疗乙肝病毒感染耐药分析

目的 分析拉米夫定治疗乙肝病毒感染耐药性,旨在为指导慢性乙肝患者临床药物治疗提供新方法.方法 应用基因芯片检测255份51名拉米夫定抗乙肝病毒治疗自愿者不同阶段服药的临床标本及145份HBV DNA阴性血清耐药突变,并对突变进行分析.结果 经一年药物治疗10名患者产生耐药突变,耐药率19.6%（10/51）,产生突变阳性标本病毒载量＞105拷贝/ml.药物治疗后产生突变＞6个月.10例突变病毒株中,552密码子处突变9例,528密码子处突变3例,密码子555中未发现突变.5例血清存在混合感染,其中4例为野生型病毒与突变型的混合,野生型病毒所占比例皆在40%以下.1例血清出现在（4,4）位点的密码子ATT与（3,3）位点密码子TTG两种突变,两种突变类型病毒并行产生同步增长.（3,3）突变类型首次报道.结论 拉米夫定抗乙肝病毒治疗6个月以上易产生耐药,产生耐药病毒载量＞105拷贝/ml.主要发生在YMDD区,且存在两种突变类型病毒的混合感染,以上结果对慢性乙肝患者用药具有指导作用.     

中枢神经系统肿瘤CDKN2基因的丢失

目的探讨中枢神经系统肿瘤CDKN2基因的丢失情况。方法采用聚合酶链反应(PCR)对81例脑、脊髓肿瘤手术标本中CDKN2基因的丢失情况进行了检测。结果胶质瘤CDKN2基因丢失率为60％,且高级别胶质瘤基因丢失率显著高于低级别肿瘤;脑膜瘤、神经鞘瘤、垂体腺瘤及转移瘤亦存在不同程度CDKN2基因的丢失。结论CDKN2基因的丢失与中枢神经系统肿瘤的发生、发展有一定的关系。     

人博卡病毒感染支气管上皮细胞生物学特征的研究

目的 研究人博卡病毒(HBoV)在呼吸道感染中的致病性及机制.方法采用人博卡病毒阳性标本感染健康人支气管上皮细胞,观察HBoV感染支气管上皮细胞后的生物学特征,并进行病毒空蚀斑、红细胞吸附抑制及免疫荧光测定.结果 75%感染细胞变圆并堆积成葡萄状,伴随有坏死、破碎、脱落.病毒蚀斑测定出典型"猫头鹰眼"现象.红细胞吸附实验观察到90%以上红细胞附着感染支气管上皮细胞.荧光检测出在细胞核内具有典型荧光块.结论支气管上皮细胞可用于分离HBoV,HBoV感染支气管上皮细胞后能够在该细胞内增殖,并导致特征性生物学改变.本研究为今后人博卡病毒致病机制研究奠定基础.     

检测人博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 建立间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测人博卡病毒(HBoV)抗体,探讨其临床应用的可行性.方法 以重组表达的HBoV融合蛋白VP2作为包被抗原,建立检测HBoV抗体的间接ELISA,优化该检测方法的最佳条件,观察其精密度、敏感度和特异性,并与荧光定量PCR方法对比检测40份临床样本,同时采用免疫印迹法(Western blot)确认其符合率.结果 所建立的间接ELISA最佳抗原包被浓度为2 mg/L,酶标二抗工作浓度为1∶5000,血清标本最佳稀释度为1∶200.该方法平均批内变异系数为6.87%,平均批间变异系数为4.67%.40份临床样本间接ELISA检测结果与荧光定量PCR及免疫印迹结果一致,符合率100%.结论 利用VP2融合蛋白作为抗原,建立的检测血清HBoV抗体间接ELISA方法特异性强、重复性好,可用于HBoV抗体的定量和定性检测.     

参麦注射液对重症急性胰腺炎大鼠细胞间黏附分子-1的影响

目的 观察参麦注射液对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠模型血中可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)水平及胰腺组织中1CAM-1 mRNA的影响.方法 将108只成年雄性SD大鼠随机分为3组:对照组(A组)、SAP模型组(B组)及参麦治疗组(C组);其中B组及C组再分为4、8、16、24h4个亚组,各个亚组及A组各12只.对各组大鼠血清中sICAM-1水平及胰腺组织中ICAM-1mRNA水平进行比较.结果 B组各时间点大鼠血清sICAM-1浓度较A组均显著升高(128.07±15.86比87.31±13.16、142.33±22.61比98.82±11.39、187.45±17.39比129.51±15.61、176.18±19.36比123.57±17.03)(P＜0.05);C组各时间点大鼠血清sICAM-1浓度较B组均显著降低(92.55±8.09比128.07±15.86、105.28±14.29比142.33±22.61、142.36±18.25比187.45±17.39、131.32±21.83比176.18±19.36)(P＜0.05);B组各时间点大鼠胰腺组织内ICAM-1 mRNA表达水平较A组均显著升高(0.97±0.12比0.52±0.11、1.08±0.18比0.61±0.13、1.32±0.18比0.82±0.14、1.23±0.09比0.74±0.13)(P＜0.05);C组各时间点大鼠胰腺组织内ICAM-1 mRNA表达水平较B组均显著降低(0.59±0.13比0.97±0.12、0.68±0.09比1.08±0.18、0.96±0.20比1.32±0.18、0.88±0.09比1.23±0.09)(P＜0.05).结论 参麦注射液通过下调SAP大鼠ICAM-1 mRNA及ICAM-1的表达,起到改善SAP大鼠微循环、保护SAP大鼠的作用.     

一种快速简便分离同位素标记DNA探针的方法

一种快速简便分离同位素标记ＤＮＡ探针的方法隋建丽周平坤侯建毅＊军事医学科学院放射医学研究所北京１００８５０核酸杂交是一项应用广泛的分子生物学研究技术，制备和分离同位素标记探针是其中一个重要步骤。以往是通过一个ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０柱将标记ＤＮＡ探针与...     

检测人博卡病毒抗体间接酶联免疫吸附法的建立及临床应用

目的 建立间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测人博卡病毒(HBoV)抗体,探讨其临床应用的可行性.方法 以重组表达的HBoV融合蛋白VP2作为包被抗原,建立检测HBoV抗体的间接ELISA,优化该检测方法的最佳条件,观察其精密度、敏感度和特异性,并与荧光定量PCR方法对比检测40份临床样本,同时采用免疫印迹法(Western blot)确认其符合率.结果 所建立的间接ELISA最佳抗原包被浓度为2 mg/L,酶标二抗工作浓度为1∶5000,血清标本最佳稀释度为1∶200.该方法平均批内变异系数为6.87%,平均批间变异系数为4.67%.40份临床样本间接ELISA检测结果与荧光定量PCR及免疫印迹结果一致,符合率100%.结论 利用VP2融合蛋白作为抗原,建立的检测血清HBoV抗体间接ELISA方法特异性强、重复性好,可用于HBoV抗体的定量和定性检测.