冻融后2-细胞胚胎发育至囊胚建立人胚胎干细胞系

目的 用解冻后废弃胚胎及部分患者捐献的冷冻胚胎建立胚胎干细胞系.方法 用程序解冻法解冻2001-2007年来我生殖中心就诊的患者剩余冷冻胚胎,培养至囊胚,Pronase酶去除透明带后,全囊胚置于小鼠饲养层(MEF)中培养获得原代细胞,机械法结合Ⅳ型胶原酶消化法传代,并利用细胞形态观察、免疫荧光染色、核型分析、畸胎瘤切片胚层分析方法对所建胚胎干细胞系进行鉴定.结果 序贯培养23枚废弃胚胎,有4枚培养到囊胚阶段;去除透明带后有2枚在MEF上贴壁生长,但只有1株成功扩增稳定传代至第80代;细胞集落呈典型的鸟巢状,有稳定的46XY核型;细胞系表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81抗原,RT-PCR检测有Nanog、Oct-4、Sox2等基因表达;同时在体外能分化为内、中、外3个胚层.结论 解冻后2～3细胞Ⅲ～Ⅳ级的废弃胚胎仍具有发育形成囊胚的潜能,并利用所得囊胚采用酶去透明带全胚培养法能建立稳定增殖的hESC细胞系.     

用11色探针检测植入前胚胎非整倍体的实验研究

目的 建立用11种不同的染色体探针进行三轮FISH杂交检测单卵裂球的技术,同时探讨胚胎中的嵌合体现象及1PN胚胎的整倍性.方法 收集IVF/ICSI治疗周期中,受精后第3天的废弃胚胎31枚,包括15枚2PN胚胎和16枚1PN胚胎用于研究.蛋白酶消化透明带,每个胚胎中吸取2、3个卵裂球,用0.2％Tween-20/0.01N HCI+甲醇/冰醋酸(3∶1)法固定,用11种染色体探针进行FISH杂交分析.结果 共获72个卵裂球,成功固定核69个,成功率为95.8％;FISH杂交后,66个核信号完整,杂交成功率为95.6％;9个胚胎为嵌合型,嵌合体率为29.0％;16个1PN胚胎中6个正常,正常率为37.5％.结论 建立了较稳定的应用11色探针进行FISH杂交诊断单卵裂球技术;第3天胚胎中嵌合体率较高,会增加PGS的误诊率;部分1PN胚胎染色体正常,在无2PN胚胎移植的情况下,1PN胚胎也可作为选择.     

精子形态分析标准化研究进展

精子形态是评价男性生育力的一项重要参数,但精子形态分析本身存在许多不足,由于质量保证措施常被忽略,实验室室间检验能力验证计划还未推广,导致实验室内部和不同实验室间的分析结果具有广泛差异性。精子形态分析需要建立完善的检测技术体系和相应的质量控制体系,本文对近年来国内外有关精子形态分析标准化的研究进展进行综述。     

不育男性血清抑制素B水平检测及临床应用

目的探讨血清抑制素B（INHB）的水平与精子发生的关系及临床应用。方法对195例不育男性患者与30例正常生育男性进行血清抑制素B和血清促卵泡成熟激素（FSH）、黄体生成素（LH）检测,并进行精液常规分析。结果①少精子症各组和非梗阻性无精子症组血清INHB均低于正常对照组。非梗阻性无精子症组与梗阻性无精子症组比较,血清INHB差异有统计学意义（P〈0.05）。②血清INHB水平与精子密度、精子总数呈显著正相关（r=0.456,P〈0.01;r=0.604,P〈0.01）,与血清FSH、LH呈显著负相关（r=-0.537,P〈0.01;r=-0.413,P〈0.01）。结论血清INHB水平可反映睾丸精子的发生情况,可作为临床评价睾丸生精作用的重要指标。     

精子DNA完整性对体外受精-胚胎移植结局的影响

目的探讨精子DNA损伤对体外受精-胚胎移植（IVF-ET）结局的影响。方法：142对夫妇接受142周期IVF-ET治疗,采用染色质扩散实验对男方精液进行精子DNA完整性检测。分析精子DNA碎片指数（DFI）与受精率、2PN受精率、卵裂率及优胚率的相关性;根据DFI值分为DFI〈30%组与DFI≥30%组,比较两组间的种植率、妊娠率和流产率。结果：精子DFI与受精率、2PN受精率及卵裂率均无显著相关性（P〉0.05）,与优胚率具有显著负相关（P〈0.05）。两组间对比,DFI〈30%组的种植率及妊娠率均高于DFI≥30%组,差异有统计学意义（P〈0.05）。DFI≥30%组的流产率高于DFI〈30%组,但差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：IVF-ET治疗中,精子DNA损伤对受精率、2PN受精率及卵裂率无影响,但对优胚率、种植率及妊娠率有负面影响,与流产率的关系需更大样本研究。建议将精子DNA完整性分析作为精子功能分析的一个常用项目。     

低评分胚胎的非整倍体分析

目的 应用荧光原位杂交技术(FISH)分析低形态学评分胚胎的染色体非整倍体情况并探讨低评分胚胎作为移植选择的安全性.方法 收集IVF/ICSI周期中的D3低评分胚胎,卵裂球固定后,应用8种不同的染色体探针进行二轮FISH杂交检测细胞核.结果 收集D3低评分胚胎40枚,获得178个卵裂球,成功固定核170个,固定成功率为95.5％(170/178);FISH杂交后163个核信号完整,杂交成功率为95.9％(163/170);40枚2PN胚胎中,未发现异常胚胎12枚,占30％,异常胚胎28枚,占70％.结论 低评分胚胎染色体异常率高,临床应用于移植或冷冻时建议结合PGS.     

精子发生相关新基因KLHL-10在无精子症及少弱精子症患者中突变筛查分析

目的:探讨精子发生相关新基因KLHL-10突变与无精子症及少、弱精子症之间的关系。方法:收集临床上不明原因的、非阻塞性无精子症及少、弱精子症患者(分别为11例、196例和118例)共325份外周血标本以及100份正常生育男性的外周血标本,抽提其DNA,采用PCR技术、变性高效液相色谱技术以及测序等手段对全部DNA样本进行KLHL-10基因的突变筛查。结果:在少精子症患者组及正常生育男性组中各发现1例及3例在1号外显子有C88→A的新的杂合突变,系同义突变;在少精子症患者组、弱精子症患者组及正常生育男性组中各检出3例、1例及4例在2号外显子有C424→A的新的杂合突变,也系同义突变;尚未发现有该基因的错义突变或微缺失。结论:KLHL-10基因错义突变或微缺失不是引起本组无精子症及少、弱精子症患者的主要致病原因,该基因在男性不育症的诊断价值有待进一步确定。     

新型精子功能分析系统的临床应用评价

目的评估新型精子功能分析系统的临床应用价值。方法采用新型精子功能分析系统与西班牙SCA系统对112例生育和不育男性精液标本进行分析和比较,并检测两系统主要参数的精密度。结果两种系统在反映生育组和不育组男性精液主要参数,诸如精子密度、活动率、前向运动率、平均运动速度(VAP)的指标上是一致的(相关系数均大于0.85),并且在生育组和不育组间各主要参数差异有统计学意义(P0.01)。两系统检测得到的主要参数,包括密度、活动率、前向运动率、平均运动速度的CV值,无论在批间还是批内都较低(15%)。结论与西班牙SCA系统比较,新型精子功能分析系统在各主要技术参数上与其具有较好的一致性,能够反映临床不同组群患者精液的差异,且具有较高的精密度。     

精子DNA损伤与精子形态、顶体完整率的关系研究

目的 探讨精子DNA损伤与精子形态和顶体完整率的关系.方法 对280例男性不育者进行精子DNA碎片指数(DFI)分析,并分析精子形态、顶体完整率.结果 严重畸形精子症组和顶体完整率异常组,精子DFI值显著增加;精子DFI≥40％组,精子正常形态率、顶体完整率均显著降低;精子DFI与正常形态率、顶体完整率呈显著负相关.结论 精子DNA损伤与精子形态、顶体完整率有密切关系,临床应结合精子DNA损伤程度和其他参数评价男性生育能力.     

应用卵裂期废弃胚胎培养建立人胚胎干细胞系的方法探索

目的：探讨应用卵裂期废弃胚胎,采用两种不同培养法建立人胚胎干细胞（hESC）系的方法。方法：将临床IVF及ICSI周期中剩余废弃的卵裂期胚胎继续培养至扩张囊胚,分别用免疫切割法及全囊胚培养法分离出内细胞团（ICM）,接种在用丝裂霉素处理过的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,用hESC培养液培养、传代,建立胚胎干细胞系。通过胚胎干细胞生物学特性、特异性表面标志物、核型分析及体内外分化全能性等传统方法进行鉴定。结果：132枚废弃的卵裂期胚胎在体外继续培养后,有28枚发育为囊胚,随机分组14枚囊胚采用免疫切割法分离ICM,未得到干细胞系;另14枚采用全囊胚培养法,最终得到1个干细胞系,经鉴定,这些细胞都具有hESC的生物学特性。结论：①部分废弃卵裂期胚胎能够发育至囊胚期,可作为建立hESC系的材料来源之一;②全囊胚培养法建系成功率高于免疫切割法,尤其适用于评分低的囊胚。