沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抑制肿瘤坏死因子α诱导HeLa细胞凋亡北大核心CSCD

目的 探讨沙眼衣原体质粒蛋白pORF5对肿瘤坏死因子α（TNF？α）诱导HeLa细胞凋亡的影响。方法 将含pORF5基因的慢病毒重组表达载体与辅助质粒共转染293T细胞制备慢病毒,慢病毒收集浓缩后再感染HeLa细胞,流式细胞仪分选获得pORF5基因稳定转染细胞株（pORF5？HeLa）,同时建立空载体转染对照细胞株（对照HeLa）。将两种细胞株分别分为两组,一组用20 μg/L TNF？α处理（处理组）,一组仅用新鲜培养基培养（未处理组）,作用6 h,Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态,流式细胞仪检测细胞凋亡率,实时 PCR检测凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl？2和Bax mRNA表达水平,Western印迹检测Bax、Bcl？2蛋白表达水平。结果 TNF？α处理细胞6 h后,Hoechst33258染色发现pORF5？HeLa和对照HeLa细胞中均可见不同程度的核固缩、碎裂,高亮蓝色凋亡小体;pORF5？HeLa细胞的凋亡率为（35.5 ± 4.5）%,对照HeLa细胞凋亡率为（63.6 ± 5.8）%,均显著高于相应未处理组［（9.5 ± 1.5）%和（7.9 ± 0.9）%,t值分别为13.53、32.36,均P 〈 0.01］。处理组pORF5？HeLa细胞中Bax和Caspase3 mRNA表达水平较处理组对照HeLa细胞分别降低72.8%和84.5%（t值分别为35.29,42.25,均P 〈 0.01）,但Bcl？2 mRNA的表达水平显著高于处理组对照HeLa细胞（t = 87.12,P 〈 0.01）。处理组pORF5？HeLa细胞中Bax蛋白表达水平亦显著低于处理组对照HeLa细胞（t = 17.58,P 〈 0.01）,而Bcl？2蛋白表达水平较对照HeLa细胞增加6.8倍,差异有统计学意义（t = 18.93,P 〈 0.01）。结论 pORF5可能通过增强抗凋亡蛋白Bcl？2降低促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表达,抑制TNF？α诱导的HeLa细胞凋亡。     

沙眼衣原体pORF5 蛋白通过激活PI3K / Akt 信号通路抑制细胞凋亡

目的:探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5 蛋白对细胞凋亡的影响,并进一步分析其分子机制,为阐明Ct 致病机制提供实验依据。方法:pGEX-6p/ pORF5 重组质粒转化XL1-blue 大肠杆菌,IPTG 诱导表达GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B 纯化及蛋白酶切除GST 标签后得到pORF5 蛋白。用不同浓度的pORF5 蛋白刺激HeLa 细胞,Western blot 检测不同时间Bax 和Bcl-2 的表达水平以及PI3K/ Akt 磷酸化水平,Hoechst 33342 及流式细胞技术分析细胞凋亡情况;HeLa 细胞经PI3K/ Akt 特异性抑制剂LY294002 预处理1 h 后,再用pORF5 蛋白刺激24 h,测定细胞凋亡率,并进一步分析凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2 的表达水平及PI3K/ Akt 磷酸化水平。结果:凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2 的表达变化与pORF5 蛋白浓度呈现一定的浓度和时间依赖性,当pORF5 蛋白浓度达10 μg/ ml 时,Bax 表达下调,Bcl-2 的表达上调,当升高至15 μg/ ml 时,Bax 和Bcl-2 的表达量变化最明显;15 μg/ ml 的pORF5 蛋白刺激HeLa 细胞24 h,Bax 和Bcl-2 表达变化最明显;流式细胞检测结果显示:pORF5 蛋白刺激组较TNF鄄琢处理组和未处理组细胞凋亡率分别降低了27.3% (P<0.01)和8.4% (P<0.05);Akt 在pORF5 蛋白刺激15 min 后发生磷酸化,30 min 后磷酸化水平达到峰值,用PI3K 抑制剂LY294002 预处理Hela 细胞后,发现Akt 的磷酸化显著减少,Bax 蛋白表达明显上调,Bcl-2 表达明显下调;LY294002 处理组细胞凋亡率相比于对照组增加了13.0% (P<0.01)。结论:pORF5 蛋白通过激活PI3K/ Akt 信号通路调节Bcl-2 和Bax 蛋白的表达抑制细胞凋亡。