白色念珠菌耐药株CYP51基因突变热点探讨

目的探讨耐唑类药物白色念珠菌CYP51基因突变发生热点. 方法从复发性外阴阴道念珠菌病(RVVC)患者分离出白色念珠菌,采用美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)公布的酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案(M-27方案)进行体外药敏试验,分离出氟康唑(FLC)及伊曲康唑(ITC)的耐药株;根据PCR-SSCP分析结果确定CYP51突变热点是1 364～1 774 bp之间,随机选择12株耐FCZ(MIC≥64 μg/ml)及ICZ (MIC≥16 μg/ml)的白色念珠菌用D1～D2、E1～E2 2对特异引物进行PCR扩增,将其产物测序,并与NCBI网站提供的白色念珠菌参考株进行比对、分析. 结果 12株耐FLC、ITC的白色念珠菌,扩增CYP51基因片段长度包括突变热点在内的667对碱基,即从1 108～1 774 bp;在12株菌当中,共发现13个位点38个碱基突变,突变频率最高的位点是第1 587位中腺嘌呤(A)被鸟嘌呤(G)取代;37个碱基突变没有引起氨基酸的改变,为无意义突变,只有1 609位的鸟嘌呤(G)被腺嘌呤(A)所取代,导致第488位的缬氨酸被异亮氨酸取代(V488I). 结论 CYP51基因突变是白色念珠菌对唑类抗真菌药物耐药机制之一;CYP51基因突变热点在1 364～1 774 bp之间,但92.3%的碱基突变是无意突变.     

氧调节基因表达和血管中细胞间相互作用的机制

低氧对血管的紧张性有显著影响。急性低氧引起肺部血管收缩,而慢性低氧则使平滑肌细胞分裂和胞外基质堆积,导致血管壁重建。细胞对低氧反应涉及生长因子、细胞素和生物信使为介导的细胞间的相互复杂作用。在低氧条件下,内皮细胞中位于VEGF(血管内皮生长因子)基因5’端上游区域的一个长为286p的增强子可增强VEGF基因的表达。然而,低氧对血管舒张因子-NO具     

马尔尼菲青霉临床分离株的rDNA ITS序列分析

目的 为设计马尔尼菲青霉种特异性引物,探讨马尔尼菲青霉病更加确切的诊断方法.方法 实验菌株为北京大学真菌和真菌病研究中心保存的4株马尔尼菲青霉,来源于国内不同地区.用真菌通用引物ITS1和ITS4 PCR扩增马尔尼菲青霉rDNAITS,扩增产物纯化后直接测序,测序结果在基因库核酸序列数据库进行同源序列搜索,并依据序列对比、分析.结果 4株临床分离的马尔尼菲青霉的rDNA ITS序列相同.与国外来源于美国、印度尼西亚、法国、澳大利亚的马尔尼菲青霉rDNA ITS序列基本一致.马尔尼菲青霉与荚膜组织胞浆菌、新生隐球菌、念珠菌的rDNAITS序列差异较大,青霉和曲霉属间rDNAITS的序列相似性较低,而青霉种间rDNAITS序列的差异不大.结论 不同来源的马尔尼菲青霉菌株间乃至不同青霉的种间的rDNA ITS序列均具有较高的同源性,提示该区可能不适于作为靶基因来设计马尔尼菲青霉的种特异性引物或探针.     

分子生物学技术在病原真菌鉴定和真菌感染诊断中的应用

近20年来,在临床上随着免疫缺陷宿主的不断增多,真菌感染率,特别是系统性条件致病性真菌的感染率在不断上升.由于真菌感染诊断存在困难,方法相对落后,导致很多患者得不到正确和及时的诊断而丧失了治疗机会.因此,发展新技术、提高真菌病诊断方法的敏感性、增加治疗手段已刻不容缓,而且,对病原真菌鉴定到种的水平也具有临床治疗和流行病学研究的双重意义.目前飞速发展的分子生物学技术为病原真菌的生物学特性研究提供了可能,各种检测手段不断被应用于真菌病的诊断及菌种鉴定中,可以使感染菌种的确立与快速诊断一步完成.     

白色念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药机制探讨

目的探讨白色念珠菌对唑类抗真菌药物的耐药机制。方法从复发性外阴阴道念珠菌病(RVVC)患者分离出白色念珠菌,采用NCCLS公布的《酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案》(M-27方案)进行体外药敏试验,分离出氟康唑(FLC)及伊曲康唑(ITC)的耐药株;随机选择4株耐FLC和ITC白色念珠菌耐药株,分别用A1-A2、B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2 6对引物进行PCR扩增,将其产物测序,并与NCBI网站提供的白色念珠菌参考株进行比对、分析。结果4株耐FLCI、TC白色念珠菌的CYP 51基因全序列比对、分析,发现有32个碱基发生了突变,但引起氨基酸的突变只有5个,分别是:第116位遗传密码GAT变成GAA,导致该位置的天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)(D116E 1株);第117位遗传密码GCT变成GGT,导致该位置的丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)(A117G 1株);第266位遗传密码GAA变成GAC,引起该位置的谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)(E266D 2株);第488位的遗传密码GTT变成ATT,导致该位置的缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)(V488I 1株);其中有1株菌分别在第266和488位同时发生了突变。结论本研究发现5个有意义的碱基突变,引起其编码的氨基酸发生了突变,其中A117G的突变目前尚未见相关报道,它在耐药机制中的作用尚需进一步探讨。     

常见皮肤癣菌18S～28S rDNA ITS序列同源性分析

目的分析常见皮肤癣菌内转录间隔区（ITS,包括5.8S rDNA）序列,探讨快速、准确鉴定菌种的方法;建立种系发生进化树,了解其亲缘关系.方法用形态学方法对16株皮肤癣菌做初步鉴定,PCR扩增各菌ITS区,扩增产物纯化、DNA测序,做序列比对、分析,建立系统发生树.结果检测了16株菌,包括未见文献报道的猪小孢子菌的ITS全序列,其中11株菌与形态学结果一致,1株菌鉴定为金孢子菌,4株菌通过这两种方法均不能确定.在基于ITS序列构建的N-J系统树中,将皮肤癣菌分成3组,这与依形态学所分的3属不同.结论ITS区序列分析法具有高度的准确性、敏感性,检测范围广泛、快速,可应用于菌种鉴定.但也有局限性,应与形态学鉴定相互补充.ITS区序列为今后更加合理地分类和命名皮肤癣菌提供了参考依据.     

种特异性引物鉴定申克孢子丝菌

目的 研究申克孢子丝菌的分子鉴定方法,为孢子丝菌感染的分子诊断奠定基础.方法 对22株申克孢子丝菌和12种12株暗色真菌临床分离株的核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)进行聚合酶链反应扩增.对10株来源于中国不同地区及1株来源于美国的申克孢子丝菌的扩增产物测序并进行分析,以获得的ITS2区序列为靶序列设计出申克孢子丝菌的种特异性引物(SSP),并用该引物扩增全部受试菌株.结果 序列分析显示,申克孢子丝菌rDNA的ITS2区相当保守,特异性引物对22株申克孢子丝菌可扩增出一条300bp的片段,其他受试菌株均为阴性.结论 应用设计出的种特异性引物,结合PCR方法,鉴定申克孢子丝菌特异、敏感、可靠,可用于临床诊断.     

少见致病性毛壳菌形态学及分子生物学特性研究

目的：研究毛壳菌的形态学和分子生物学特性,为临床快速准确地鉴定此类真菌奠定基础。方法：对8株3种毛壳菌在不同培养基上的形态、显微镜下形态和不同温度生长情况进行研究,同时对其rDNA的ITS区进行序列分析,并且根据其序列的差异设计球毛壳菌的种特异性引物。结果：不同种毛壳菌的培养表现及显微镜下形态有其各自的特点。8株菌在燕麦培养基上28℃时生长较好,37℃时不能生长。毛壳菌种间rDNA的ITS区序列存在较大差异,根据此差异设计出的球毛壳菌种特异性引物具有较好的特异性。结论：根据培养形态、显微镜下表现以及基因序列的差异可以对毛壳菌进行准确的鉴定。     

皮炎外瓶霉的核糖体基因研究

目的:探讨不同来源、不同致病性的皮炎外瓶霉在基因学上是否具有差异性.方法:试验菌株包括皮炎外瓶霉16株(模式株、标准株、临床及自然分离株),甄氏外瓶霉1株(标准株),丛梗孢外瓶霉1株(临床株).煮沸冷冻法提取DNA,常规PCR扩增核糖体基因及其转录间隔区,应用限制性片段长度多态性、DNA多序列分析方法等进行研究.结果:皮炎外瓶霉核糖体基因及其转录间隔区较为保守,PCR-RFLP对于该菌种的鉴定具有较大意义;DNA序列分析显示,不同来源、不同致病性的皮炎外瓶霉分属于不同的生物群落,提示不同群落致病性的差异存在一定的遗传学基础.结论:皮炎外瓶霉核糖体基因及其转录间隔区序列保守,对于该菌种的分类鉴别具有重要的意义.