链脲佐菌素诱导的小鼠糖尿病视网膜病模型及促血管新生分子的表达

目的：：建立链脲佐菌素( streptozotocin, STZ)诱导的小鼠增殖性糖尿病视网膜病( proliferative diabetic retinopathy, PDR)动物模型,并观察在增殖性糖尿病视网膜病发生、发展过程中血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor, VEGF)及其受体(VEGFR1, VEGFR2),金属基质蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2, MMP9表达的变化。方法：C57 BL/6 J小鼠连续5 d腹腔注射STZ (55 mg/kg )。末次注射后7d检测血糖浓度。糖尿病诱导成功的小鼠和正常小鼠继续饲养3~5 mo。实验结束后进行视网膜病理组织观察,并利用CD31免疫荧光染色检测视网膜血管的分布情况。采用实时定量荧光 PCR 分析检测 VEGF, VEGFR1, VEGFR2, MMP2, MMP9的基因表达。结果：视网膜组织病理观察和CD31免疫荧光染色实验结果均表明5月龄的糖尿病小鼠视网膜组织中血管数目明显比同月龄正常小鼠多。同时,与同月龄正常小鼠相比,5月龄糖尿病小鼠视网膜组织中 VEGF, VEGFR1, VEGFR2, MMP2, MMP9的基因表达也明显增加。结论：本研究表明STZ诱导的糖尿病小鼠在5月龄时发生     

鼓槌石斛对小鼠非增殖性糖尿病视网膜病变的改善作用及其机制研究

目的观察鼓槌石斛乙醇提取物(ethanol extract of Dendrobium chrysotoxum,EEDC)对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病小鼠非增殖性糖尿病视网膜病变(NPDR)的改善作用及其机制。方法采用STZ诱导小鼠发生糖尿病,进而建立糖尿病并发症NPDR实验动物模型,再给予EEDC进行干预。采用视网膜组织伊文思蓝渗漏实验观察NPDR小鼠中血-视网膜屏障(BRB)的破坏情况;采用real-time PCR(RT-PCR)检测视网膜组织中白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF-α)及早期生长反应因子(Egr-1)、组织因子(TF)、纤溶酶原激活物抑制剂1(Serpine 1)的基因表达;进一步采用酶联免疫实验(ELISA)检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α及TF、Serpine 1的量。结果与对照组相比,模型组小鼠视网膜组织伊文思蓝渗漏量明显增加,EEDC能够减少视网膜组织伊文思蓝渗透量;EEDC能够显著降低模型小鼠视网膜组织中增加的IL-1β、IL-6、TNF-α及Egr-1、TF、Serpine 1的基因表达;EEDC能够明显下调模型小鼠血清中增加的IL-1β、IL-6、TNF-α及TF、Serpine 1的量。结论 EEDC具有改善STZ诱导小鼠NPDR的作用,其机制为通过抑制NPDR小鼠视网膜和血清中增加的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α以及与凝血/纤溶相关基因TF、Serpine 1的基因表达,缓解BRB的破坏,从而发挥改善NPDR的作用。     

金银花水提物对小鼠糖尿病视网膜病的改善作用北大核心CSCD

目的观察金银花水提物(Lonicerae Japonicae Flos aqueous extract,FL)对糖尿病视网膜病(diabetic retinopathy,DR)的改善作用及其机制。方法采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射制备C57小鼠糖尿病模型,给药2个月后形成了DR早期病程阶段即非增殖性糖尿病视网膜(non-proliferative DR,NPDR)。使用伊文氏蓝实验检测血-视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)的渗漏情况;运用Western blot实验检测相关蛋白的表达;酶联免疫实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中炎性因子的表达。结果伊文氏蓝实验发现FL可以剂量依赖性的抑制STZ诱导糖尿病小鼠中发生的BRB渗漏。Western blot结果显示FL可以抑制STZ诱导糖尿病小鼠视网膜组织中核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65亚单位的转核激活,FL还可以抑制视网膜组织中kappa B抑制剂(inhibitor ofκB,IκB)、抑制性κB激酶(inhibitor of nuclear factorκB kinase,IKK)、p65的磷酸化激活。进一步研究发现FL可以抑制STZ诱导糖尿病小鼠视网膜组织中升高的小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)的表达,提示FL可以抑制神经小胶质细胞的活化。ELISA实验结果发现FL能降低STZ诱导糖尿病小鼠血清中升高的炎性细胞因子如白介素(interleukin,IL)-6,-1β。结论 FL可能通过抑制神经小胶质细胞的活化,抑制NF-κB介导的炎性信号通路,缓解视网膜的炎性损伤和BRB的渗漏,从而发挥改善DR的药效活性。     

鼓槌石斛改善糖尿病性视网膜病活性及其机制

目的 观察鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl.)乙醇提取物(DC)对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导小鼠糖尿病性视网膜病(DR)的改善作用,并研究其可能的机制.方法 采用STZ诱导C57小鼠发生糖尿病(DM),进而诱导产生DR,并给予DM小鼠DC干预.通过视网膜血管免疫荧光染色和视网膜组织苏木精-伊红(HE)染色来检测视网膜血管新生情况;采用实时PCR和酶联免疫分析(ELISA)分别检测视网膜组织血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)通路基因表达情况和玻璃体、血清中VEGF含量.结果 DC不同剂量均能够明显降低STZ诱导的糖尿病小鼠视网膜血管新生程度;研究其机制发现,DC能降低STZ诱导的糖尿病小鼠视网膜内增加的低氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α,HIF-1 α),VEGF及其受体VEGFR1和VEGFR2的基因表达,并能降低STZ诱导的糖尿病小鼠玻璃体和血清中增加的VEGF含量.结论 DC具有改善DR的药效活性,其机制为抑制VEGF信号通路的基因表达,并降低玻璃体和血清中的VEGF水平,进而抑制DR病变过程中的视网膜血管新生.     

肿瘤坏死因子α介导银屑病脂肪酸去饱和酶2低表达

【摘要】 目的 探讨脂肪酸去饱和酶2（FADS2）在银屑病皮损中的表达变化及其影响因素。方法 通过Gene Expression Omnibus（GEO）数据集GDS4602统计分析银屑病患者皮损FADS2的表达变化。取5只咪喹莫特诱导的C57BL/6小鼠银屑病模型背部皮肤,并取收集于上海市皮肤病医院的人正常对照皮肤和银屑病患者英夫利西单抗治疗前及10周后的皮损组织标本各4份以及司库奇尤单抗治疗前及12周后的皮损组织标本各3份,免疫组化染色检测表皮中FADS2的表达。体外培养的人永生化角质形成细胞HaCaT用50 ng/ml肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激0、6、12或24 h,用200 ng/ml白细胞介素17A（IL-17A）刺激0、6、12 h;用TNF-α单独或联合NF-κB通路抑制剂BAY 11-7082（5 μmol/L）刺激6 h。处理完成后,实时荧光定量PCR（qPCR）、Western印迹法分别检测FADS2 mRNA和蛋白的相对表达量。采用单因素方差分析法和t检验进行统计分析。结果 GDS4602统计结果显示,与人正常皮肤对照组FADS2基因表达水平（2.035 ± 1.226）相比,银屑病皮损（0.656 ± 0.475）及非皮损（1.503 ± 1.062）组织中显著降低,F值分别为55.17、3.07,P值分别＜0.001、 = 0.012,并且皮损处显著低于非皮损处（F = 26.27,P＜0.001）。Western印迹和免疫组化染色显示,与正常对照组小鼠皮肤FADS2蛋白表达（灰度值比值：1.000;荧光强度：30.720 ± 6.850）相比,咪喹莫特组小鼠皮损表达显著降低（灰度值比值：0.463 ± 0.172,t = 7.00,P = 0.002;荧光强度：21.840 ± 3.125,t = 3.15,P = 0.035）。银屑病患者使用英夫利西单抗治疗10周后,皮损中FADS2蛋白表达（43.775 ± 3.342）较未治疗时（27.950 ± 1.218）显著升高（t = -6.95,P = 0.006）;而使用司库奇尤单抗治疗12周后的银屑病患者皮损处FADS2 蛋白表达（28.667 ± 3.402）与治疗前（31.933 ± 2.987）比较没有显著升高（t = 2.72,P = 0.113）。qPCR显示,与HaCaT细胞TNF-α 0 h组相比,TNF-α 6 h组、12 h组FADS2 mRNA相对表达量显著降低（P值分别为0.002、0.003）;与IL-17A 0 h组相比,IL-17A 6 h组、12 h组相对表达量变化无统计学意义（P值分别为0.849、0.961）。与HaCaT细胞对照组（正常培养基培养,1.000）相比,TNF-α 6 h组FADS2 mRNA相对表达量显著降低（0.682 ± 0.132,t = 4.82,P = 0.017）;与TNF-α 6 h组相比,TNF-α + BAY 11-7082 6 h组显著升高（1.541 ± 0.525,t = -3.58,P = 0.037）。Western印迹显示,与HaCaT细胞TNF-α 0 h组相比,TNF-α 24 h组FADS2蛋白相对表达量降低（F = 6.24,P = 0.013）。结论 FADS2在银屑病皮损中表达下降,其表达下调可能与TNF-α有关。     

节律基因隐花色素2在银屑病小鼠模型及HaCaT细胞中的表达变化及机制研究

【摘要】 目的 探讨节律基因隐花色素2（CRY2）在银屑病小鼠模型及HaCaT细胞中的表达变化及其机制。方法 咪喹莫特诱导小鼠模型实验：12只C57BL/6雌鼠随机均分为咪喹莫特组（连续外用咪喹莫特乳膏5 d诱导构建银屑病小鼠模型,6只）和对照组（不予任何处理,6只）,第6天处死小鼠,取其背部皮肤组织,免疫荧光染色检测表皮中CRY2的表达。HaCaT细胞转染实验：使用小干扰RNA（siRNA）技术在HaCaT细胞中敲减CRY2的表达（siRNA-CRY2组）,以siRNA-NC组作为对照,5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷（EdU）染色检测HaCaT细胞增殖活力,实时荧光定量PCR（qPCR）检测HaCaT细胞中趋化因子mRNA表达水平,Western印迹检测细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）蛋白的磷酸化水平。肿瘤坏死因子α（TNF-α）刺激动物和细胞实验：12只C57BL/6雌鼠随机均分为TNF-α组（小鼠耳部皮下连续注射TNF-α溶液6 d,6只）和磷酸盐缓冲液（PBS）组（注射等量的PBS,6只）,第7天处死小鼠,取其耳部皮肤组织,免疫荧光染色检测表皮中CRY2的表达;用50 ng/ml TNF-α刺激CRY2基因敲减的HaCaT细胞12 h（siRNA-CRY2 + TNF-α组）,以siRNA-NC + TNF-α组作为对照,qPCR检测各组细胞中趋化因子mRNA的表达。统计分析采用两独立样本t检验。结果 免疫荧光染色显示,咪喹莫特组小鼠背部表皮层中CRY2蛋白的表达（0.94 ± 0.23）显著低于对照组（2.30 ± 0.25,t = 3.99,P = 0.016）。HaCaT细胞转染实验：siRNA-CRY2组EdU阳性细胞比例（48.13% ± 10.97%）显著高于siRNA-NC组（38.23% ± 0.81%,t = 5.00,P = 0.007）,且siRNA-CRY2组趋化因子CXCL1、CXCL8 mRNA相对表达量及p-ERK1/2蛋白相对表达量均显著高于siRNA-NC组（均P < 0.05）,但两组间CCL20 mRNA表达量及ERK1/2蛋白表达量差异无统计学意义（均P > 0.05）。TNF-α刺激实验：免疫荧光染色显示,TNF-α组鼠耳表皮组织中CRY2蛋白表达水平（0.37 ± 0.34）显著低于PBS组（2.04 ± 0.17,t = 4.38,P = 0.012）;siRNA-CRY2 + TNF-α组HaCaT细胞趋化因子CXCL1、CXCL8、CCL20 mRNA相对表达量均显著高于siRNA-NC + TNF-α组（均P < 0.05）。结论 CRY2在银屑病小鼠模型中表达降低,促进了角质形成细胞的增殖以及趋化因子CXCL1、CXCL8和CCL20的表达,且TNF-α可能是下调CRY2表达的上游细胞因子。