被动免疫预防犊牛轮状病毒感染的研究

目的 轮状病毒灭活疫苗免疫孕牛后，研究产下犊牛通过母源抗体获得的被动免疫在预防牛轮状病毒感染中的作用。方法 孕牛产前2月和1月分别接种轮状病毒灭活疫苗，检测产牛后乳汁和犊牛血样中BRV特异性IgG、IgA及中和抗体滴度。犊牛21日龄时口服2mL10^4,59 TCID50／ml的牛轮状病毒，观察犊牛腹泻及排毒情况。结果 免疫组乳清和犊牛血清中产生了高水平的牛轮状病毒特异性IgG、IgA及中和抗体，与对照组差异极显著（P〈0．01）；攻毒后，对照组6头犊牛全部发生腹泻，免疫组6头中有1头腹泻，发病的潜伏期及发病率差异显著。结论 被动免疫可显著提高犊牛血清中牛轮状病毒特异性抗体水平，使犊牛获得一定的免疫保护力抵抗轮状病毒的感染。     

A组牛轮状病毒基因工程亚单位疫苗的初步研究

目的构建轮状病毒外膜蛋白VP4、VP7基因与大肠杆菌LTB蛋白基因的重组表达载体,研究重组表达蛋白的免疫原性,为研制犊牛腹泻基因工程亚单位疫苗奠定基础。方法克隆A组牛轮状病毒临床分离株CHLY的VP4、VP7基因和大肠杆菌LTB基因,插入pET32a中构建了4个原核表达载体pET32a／VP7、pET32a／VP4、pET32a／VP7-LTB、pET32a／VP4-LTB,转化到BL21（DE3）中进行表达纯化,纯化蛋白与弗氏佐剂混合免疫10w龄雌鼠,在实验期间对雌鼠进行交配,对其所产乳鼠用150μL10^-6.5／0．1mL TCID20的轮状病毒进行攻毒以研究重组蛋白免疫原性和攻毒保护性。结果重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中以包涵体的形式存在,Bandscan扫描分析结果显示,它们分别占菌体总蛋白的35％、20％、30％、18％,利用Ni-NTA Agarose在变性条件下成功纯化得到高纯度重组蛋白。10w龄雌鼠免疫试验表明rVP4-LTB组激发了最强的免疫反应,rVP4组次之,rVP7-LTB组略高于rVP7,各个免疫组问的差异性不显著（P〉0．05）,各实验组IgG抗体水平显著高于空质粒对照组（P〈0．01）。雌鼠所产乳鼠的攻毒实验表明,免疫组雌鼠所产乳鼠腹泻率为13．35％～23．8％,腹泻持续时间为48h～72h,较空质粒对照组明显降低,腹泻症状较轻且症状持续时间明显缩短。四个重组蛋白组攻毒保护率为76．2％～86．7％,rVP7-LTB、rVP4-LTB两组略高于rVP7、rVP4组,但相互间差异不显著（P〉0．05）。结论重组蛋白具有较好的免疫原性,被免疫雌鼠体内产生的中和性抗体可以经被动免疫过程传递至子代,并为仔鼠提供保护。本研究为犊牛轮状病毒基因工程疫苗的研究奠定了一定的基础。     

半巢式RT-PCR快速检测犊牛轮状病毒方法的建立

目的根据牛轮状病毒的VP7基因设计了一对可以检测牛轮状病毒G6血清型的引物,成功地检测了牛轮状病毒G6血清型。使用该方法检测牛病毒性腹泻-粘膜病病毒,检测结果为阴性。敏感性试验表明本实验方法可以检测10-4稀释的样品。通过对23份临床样本的检测证实,PCR方法比聚丙烯酰胺凝胶电泳和病毒的分离试验灵敏度高,可以快速诊断轮状病毒病,并且能够同时鉴定轮状病毒主要血清型。     

直接从粪便中检测致犊牛腹泻产肠毒素大肠杆菌的双重PCR方法的建立与应用

目的产肠毒素大肠杆菌(Enterototxigenic,Escherichia Coli,ETEC)是造成人和动物腹泻的主要病原之一,也是造成新生乳用犊牛腹泻的主要原因,一株ETEC可能产生一种或者多种肠毒素。根据产肠毒素大肠杆菌产生的两种主要毒素的基因序列,设计了两对引物,建立多重PCR方法。该方法仅用4.5小时即可检测出导致犊牛腹泻的产肠毒素大肠杆菌菌株,具有敏感度高、特异性强和检测速度快等特点。本试验的目的是用所建立的多重PCR方法来确定ETEC在导致犊牛腹泻中的作用。采用该方法对乳用犊牛的203个腹泻样品进行了检测,结果,用传统的分离培养方法得到的203株典型大肠杆菌中有135株为ETEC;其中LT阳性为105株,ST阳性为126株,LT+ST阳性的为96株,阳性率为66.5%。而采用直接从粪样中提取PCR模板的方法进行PCR,检测到146个犊牛粪样为ETEC阳性,其中LT阳性为112株,ST阳性为137株,LT+ST阳性为103株,阳性率为71.9%,明显高于传统的检测方法;并且所检测到的146个ETEC阳性的犊牛粪样完全包含用传统的分离培养方法得到的135个阳性粪样,且基因分型结果相同。