降血压肽前体的设计和克隆及其在大肠埃希菌中的表达

目的 降血压肽(antihypertensive peptide, AP)是一类能降低人体血压的小分子肽,是血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin convering enzyme inhibitor, ACEI),可通过抑制体内血管紧张素Ⅱ的生成达到降低血压的目的 .AP通常含有少数几个氨基酸残基,难以直接表达,因此文中设计含多种降压活性肽段的AP前体(antihypertensive peptide precursor, APP),构建原核表达载体,并在所构建的基因工程菌进行表达. 方法 筛选多种已报道的具有高体内降压活性的AP,经胃肠消化酶酶切位点串联成APP.基于大肠埃希菌偏爱密码子,人工合成相应的多肽基因(app),PCR扩增,克隆至表达载体pET-22b,转化E.coli BL21感受态细胞.重组质粒经双酶切和DNA测序鉴定,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(sopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达重组APP. 结果 APP基因正确克隆至表达载体pET-22b中.诱导表达产物经SDS-PAGE分析,显示在相对分子质量11000处出现条带,与预期的重组APP大小相符. 结论 人工设计的APP在大肠埃希菌中获得成功表达,为AP的工业化制备打下基础.     

副溶血性弧菌vpa0166基因与耐药性相关性研究

目的 了解2006-2014年江苏省部分地区的副溶血性弧菌分离株基因型特征,并探索编码推测外膜蛋白VPA0166的分子多样性与耐药性的关系。方法 对166株分离株采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法鉴定tlh、tdh、trh毒力基因、大流行株标志物orf8基因以及外膜蛋白编码序列vpa0166,并用纸片扩散法(Kindy-Bauer,KB)进行药敏试验。结果 测序分析发现vpa0166扩增片段呈现a型(996 bp)和b型(1050 bp)两个形态(同源性为94%),其中a型产物较b型产物在523 bp至580 bp之间有54个碱基缺失,药敏结果表明a型菌群对环丙沙星的敏感率显著高于b型菌群(P<0.05)。结论 vpa0166序列多样性与环丙沙星耐药性存在显著相关性。     

副溶血性弧菌Vop T蛋白的表达及其抗体的毒力菌株特异性研究

目的 研究副溶血性弧菌VopT蛋白的菌群特异性,为建立致病性副溶血性弧菌的快速检测方法以及探讨VopT的作用机制奠定基础。方法 根据副溶血性弧菌VopT蛋白基因(VPA1327)序列设计合成引物,通过PCR从副溶血性弧菌致病株WX06152(血清型O3∶K6)中扩增出目的基因,构建原核表达载体pET-30a(+)-VPA1327并转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,重组蛋白应用MALDI-TOF-MS/MS鉴定和His镍柱纯化,并通过免疫BALB/c小鼠制备抗血清,建立副溶血性弧菌VopT蛋白的间接ELISA检测方法,并分析其敏感性和毒力菌株特异性。结果 成功表达了大小为33 kDa融合蛋白,肽指纹图谱与副溶血性弧菌VopT蛋白一致。重组VopT抗血清能够特异性检测副溶血性弧菌毒力株的全菌细胞及其裂解蛋白,与环境株及其它种属菌株无明显交叉反应,灵敏度达到10⁵CFU·mL^-1。结论 重组VopT的抗血清具有良好特异性,为探讨VopT致病机理和分泌机制研究提供了一定的参考依据。