eIF-5A的亚细胞定位研究

目的：研究eIF-5A的亚细胞定位,为了解其生物学功能提供线索。方法：借助免疫荧光技术和GFP标签技术,用激光共聚焦显微镜检测eIF-5A的亚细胞定位。结果：免疫荧光检测结果表明,eIF-5A定位于细胞质中;GFP-5A瞬时转染后,起初eIF-5A为全细胞分布,以后逐渐转移到细胞质中。第50位赖氨酸突变为丙氨酸后的eIF-5A则分布于整个细胞。结论：eIF-5A具有核质穿梭功能,它的亚细胞定位是个动态变化过程,hypusine可影响其亚细胞定位,进而可能影响其功能的发挥。     

荧光素酶标记的BEL-7405细胞体内外成像及肿瘤动物模型建立

目的 筛选表达荧光素酶(luciferase)基因的人单克隆肝癌细胞系,用活体成像技术(bioluminescent imaging)在细胞及整体动物水平检测其发光能力,为监测肿瘤生长和转移建立一种新的肿瘤动物模型.方法 构建表达荧光素酶基因的真核表达载体并将其转入肝癌细胞(BEL-7405),用G418筛选稳定表达荧光素酶的单细胞克隆,在体外用活体成像技术评价其稳定发光能力.BALB/c nu/nu裸鼠皮下接种1×106个发光细胞使其成瘤,活体内观察肿瘤的生长及转移情况.结果 在肝癌细胞中获得稳定表达荧光素酶的克隆,利用活体成像技术可检测到细胞克隆发光.将稳定表达荧光素酶的克隆皮下接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长过程,肿瘤发光随着观察时间的延长而增强,但是没有观察到肿瘤转移的现象.结论 本研究筛选得到了稳定表达荧光素酶的肿瘤单克隆细胞系,结合活体成像技术,建立了一套新的能够用于活体内监测肿瘤生长的研究方法.     

利用荧光极化技术在均相系统内建立基于Bcl-2/Bak作用模式的高通量药物筛选体系

目的：利用荧光极化原理，在液相系统内建立基于Bcl-2／Bak相互作用模式的高通量药物筛选体系。方法：在液相系统内建立Bd-2蛋白和多肽的相互作用体系，用光度计检测荧光极化值，分析荧光极化值随蛋白或多肽浓度变化而改变的趋势。结果：对应于Bak蛋白BH3结构域的5FAM标记肽（LP）可与Bcl-2蛋白相互作用，建立了二者相互作用的饱和曲线；非标记竞争性短肽（CP）和LP竞争性地与Bcl-2蛋白结合，而无关肽（NP）则不与Bcl-2相互作用；基于Bcl-2结构筛选到的小分子化合物SC对体系内LP荧光极化值的影响模式与CP相同。结论：在均相系统内初步建立了基于抑制Bcl-2活性进而促进细胞凋亡的药物高通量筛选方法，为实现药物的高通量筛选奠定了基础。     

应用酵母双杂交筛选与hSOX4相互作用的蛋白质

目的：寻找与hSOX4相互作用的蛋白质，为该基因的功能研究提供新的线索。方法：采用酵母双杂交方法，以hSOX4的第1～133位氨基酸SOX4（1-133）和第130-380位氨基酸SOX4（130-380）分别作为诱饵筛选人乳腺文库，经过重复验证排除假阳性以确定阳性克隆。结果：以SOX4（1-133）作为诱饵最终筛出了4个阳性克隆，经测序及生物信息学分析，这4个克隆为同一基因来源：UBE2I（ubiquitin-conjugating enzyme E2I，Ubc9）。以SOx4（130-380）为诱饵未能筛出阳性克隆。结论：Ubc9能与SOX4（1-133）发生相互作用，它们的相互作用可能与SOX4的转录调控有关。     

人Bcl-2蛋白的基因克隆、表达及初步活性分析

目的：以特定形式对高度疏水性的人Bcl-2(hBcl-2)蛋白进行可溶性表达，获得非疏水性hBcl-2蛋白并具备生物学结合活性，为进一步研究hBcl-2三维结构并在此基础上研发特异性小分子药物提供充足的蛋白样品。方法：用PCR方法对hBcl-2基因进行克隆重组，插入原核表达载体pET28a( )中。用Western Blot和MALDI-TOF生物质谱鉴定，采用荧光极化方法进行活性测定。结果：重组hBcl-2在E．Coli中实现了高效、可溶性的融合表达，重组蛋白经纯化至电泳纯，具备了与Bcl-2家族Bak蛋白BH3功能域特异结合的能力，表明原核表达的重组hBcl-2具有较好的结合活性。结论：成功地对重组hBcl-2蛋白进行了可溶性表达和活性测定。     

锚蛋白重复序列通过NF-κB信号通路参与肠炎相关肿瘤的调控

目的:探讨锚蛋白重复序列(gann ankyrin repeats,Gankyrin)在炎症相关肿瘤进展中的作用机制.方法:将36只同系C57BL/6♂鼠随机分为3组,其中12只服用2.5%葡聚糖硫酸钠盐(dextransodium sulfate,DSS)饮水建立溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型,其中12只首日腹腔注射氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM),10 d后开始服用2%DSS 7 d,恢复正常饮水2 wk后再次口服2%DSS共3个循环,建立结肠炎相关肿瘤(colitis-associated cancer,CAC)模型,另有12只同种系小鼠口服普通饮水饲养作为对照组.分别采用病理组织学苏木精-伊红(hematoxylineosin,HE)染色观察结肠组织;并用实时荧光定量PCR方法检测3组结肠组织中Gankyrin的m RNA水平;采用双荧光报告系统检测Gankyrin对肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α和白介素(interleukin,I L)-1β刺激下核因子-κB(nuclear factor-κB,N F-κB)转录活性的影响,同时用免疫印迹方法检测转染效率.结果:病理组织学HE染色证实了UC和CAC小鼠模型的建立;3组小鼠结肠组织中Gankyrin mRNA表达明显不同,在肿瘤组织中Gankyrin mR N A水平明显高于炎症组织;在H C T116细胞中过表达Gankyrin能够明显抑制TNF-α和IL-1β刺激引起的NF-κB转录活性,而干涉Gankyrin后得到的结果则相反.结论:在肠炎进展至肠癌过程中Gankyrin的表达明显上调,可能通过NF-κB信号通路参与肠炎相关肿瘤的调控.     

干涉Gankyrin基因表达对小鼠乳腺癌转移的影响

目的 建立稳定干涉癌基因Gankyrin的4T1-luc细胞株,探讨Gankyrin对小鼠乳腺癌转移的影响.方法 采用慢病毒感染和抗性筛选方法获得稳定干涉Gankyrin的乳腺癌细胞株4T1-luc/shGankyrin,通过蛋白质印迹和实时定量PCR方法分别在蛋白质和mRNA水平检测Gankyrin的干涉效果;选用BALB/c小鼠进行4T1细胞原位种植,利用活体成像技术实时观测小鼠体内肿瘤生长和肿瘤转移情况,并对小鼠肺转移瘤进行病理学分析.结果 采用免疫印迹和实时定量PCR,检测稳定敲低Gankyrin 4T1细胞在蛋白质水平和mRNA水平的表达,均明显低于对照细胞,与对照细胞相比,不同干涉序列的4T1细胞mRNA水平分别为对照细胞的4.9％、25.1％、69.8％.利用活体成像进行细胞数与细胞发光强度的检测,选择细胞数与发光强度基本一致的#2细胞株进行小鼠原位种植,其产生的转移瘤进行实时观测,结果显示敲低Gankyrin的4T1细胞诱导的肺转移瘤荧光强度为3.02×106,而对照细胞为10.9×106,同时病理学证实了对照细胞产生的肺转移瘤免疫组织化学Gankyrin染色阳性,而敲低Gankyrin的4T1细胞的肺转移瘤免疫组织化学Gankyrin染色阴性.结论 采用慢病毒感染的方法可以有效建立稳定敲低Gankyrin表达的细胞株;Gankyrin稳定干涉后对小鼠乳腺癌转移具有明显的抑制作用.Gankyrin有可能成为新的肿瘤治疗靶点.     

eIF-5A与hypusine

翻译起始因子eIF-5A在真核细胞内普遍存在，是目前为止惟一发现含独特氨基酸hypLlsine残基的蛋白。hypusine是eIF-5A前体的特定赖氨酸残基(第50位)经亚精胺依赖性的翻译后修饰形成的，每一成熟的eIF-5A仅含一个hypusine残基，eIF-5A的hypusine修饰是其发挥功能、细胞存活和增殖所必需的。本文对eIF-5A的研究历史、现状和hypusine功能的近期进展进行了概述，并进一步分析了eIF-5A的可能功能及hypusine修饰过程作为药物靶标诱导细胞凋亡的应用前景。     

真核起始因子5A与细胞周期G1-S调控的研究

真核启始因子5A(eIF-5A)翻译后第49位的赖氨酸被修饰为一个特殊氨基酸hypusine，后是其发挥功能所必需的。本研究用eIF-5A翻译后hypusine修饰的特异性阻断剂1，7-二氨基庚烷(1，7-diaminoheptane，DAH)处理白血病细胞系(TF-1，THP-1和Mo7e)和人乳腺癌细胞系(MCF-7)，用FCM和台盼蓝拒染法检测其对细胞增殖和活性的影响；应用两步胸腺嘧啶核苷阻断法使细胞周期同步化，并用免疫印迹法检测eIF-5A在细胞周期时相的表达情况。结果表明：用1，7-二氨基庚烷处理后，细胞生长明显受到抑制，并有一定的促凋亡效应；且细胞周期被特异性阻滞于G1／S期；eIF-5A在细胞周期的S期和G2／M期的表达量较低，在G1期表达量明显增加。结论：eIF-5A的hypusine修饰参与了细胞周期调控，且与G1／S转换相关蛋白质的表达调控相关。