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目的:在大肠杆菌中表达人肥大细胞类糜蛋白酶(hMCC)N端片段(hMCC-N),并制备其鼠源性多克隆抗体。方法:通过PCR法扩增hMCC-N端基因片段,将其克隆至pMAL-c2x原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白的表达,通过Amylose树脂亲和层析纯化目的蛋白,以纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备鼠抗hMCC-N端片段多克隆抗体,并以间接ELISA测定抗体效价,以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果:PCR扩增得到360bp的hMCC-N端基因片段,克隆入表达载体pMAL-c2x,构建了与标签蛋白麦芽糖结合蛋白基因融合表达载体pMAL-c2x/hMCC-N,融合蛋白在大肠杆菌中得到了稳定表达,并经亲和层析,纯化出可溶性的重组蛋白,用其免疫小鼠,获取了鼠抗hMCC-N端片段的多克隆抗体,ELISA结果显示效价达1∶12800,Westernblot分析表明该抗体能特异结合hMCC。结论:成功地制备了效价高、特异性较强鼠抗hMCC-N端片段抗体,为进一步建立hMCC的ELISA检测方法打下了良好的基础。 相似文献
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目的: 制备兔抗人CD1d分子α3结构域(hCD1d-α3)多克隆抗体.方法: PCR法扩增出人hCD1d-α3编码区基因, 将其克隆入原核表达载体pET28中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 用IPTG诱导重组蛋白的表达, 用Ni2 -NTA Agarose亲和层析法纯化重组蛋白, 以之为免疫原免疫家兔, 制备多克隆抗体, 并用ELISA、 Western blot及免疫组织化学法检测抗体.结果: 成功构建了hCD1d-α3原核表达载体pET28/hCD1d-α3, 高效表达并纯化hCD1d-α3蛋白, 间接ELISA检测所制备抗体的效价为1∶6 400, Western blot显示该抗体能与hCD1d特异结合, 免疫组织化学法检测结果表明该抗体识别人小肠组织中的天然hCD1d.结论: 通过制备重组hCD1d-α3蛋白为免疫原, 免疫家兔, 成功地制备了效价高、特异性好的抗hCD1d-α3多克隆抗体. 相似文献
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