Na^＋／H^＋交换器-1抑制诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的可能机制

背景：肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMC)的增殖在缺氧肺动脉高压肺血管重构中起重要作用。解放军第三军医大学附属新桥医院全军呼吸研究所在前期实验中通过构建Na^+／H^+交换器-1(sodium／pmton exchanger isofom-1，Na^+／H^+exchanger isoflorm-1，Na^+／H^+ antiporter isoform-1，NHE-1)特异性核酶基因逆转录病毒载体，转染入体外培养的大鼠PASMC内表达，发现NHE-1抑制可诱导细胞内酸化而抑制PASMC增殖，并促进其凋亡。但这种促凋亡作用是通过什么途径来完成，尚不清楚。目的：探讨Bcl-2、Bax蛋白表达在NHE-1抑制而诱导大鼠PASMC凋亡中的作用。设计：分组对照实验。地点和材料：实验在解放军第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所完成。转染表达NHE-1特异性核酶基因的体外培养大鼠PASMC(PRZ细胞)、转染PLXSN空载体的大鼠PASMC(PX细胞)、未处理大鼠PASMC细胞(PA细胞)为前期实验所制备。干预：已构建NHE-1特异性核酶基因逆转录病毒载体，转染入体外培养的大鼠PASMC内表达，同时转染pLXSN空载体入另一组大鼠PASMC内，后者与未转染的大鼠PASMC细胞为对照组。用荧光指示剂(Fura-2／AM)测定法检测转染NHE-1特异性核酶基因的大鼠PASMC内Ca^2+([Ca^2+]i)变化；RT-PCR方法检测细胞内Bcl-2和Bax mRNA表达变化，免疫组化法检测细胞内Bcl-2和Bax蛋白表达变化。主要观察指标：①转染NHE-1特异性核酶基因的大鼠PASMC内Ca^2+([Ca^2+]i)变化。②细胞内Bcl-2和Bax mRNA表达变化。③细胞内Bcl-2和Bax蛋白表达变化。结果：转染NHE-1特异性核酶基因后，大鼠PASMC内[Ca^2+]i显著升高，细胞内[Ca^2+]i在PA细胞[(95．94&;#177;6．39)nmol／L]与PX细胞[(98．08&;#177;7．37)nmol／L]之间差异无显著性意义(P&;gt;0．05)，而PRZ细胞[(198．08&;#177;16．59)nmol／L]显著高于PA细胞及PX细胞，差异有显著性意义(P&;lt;0．001)。Bcl-2 mRNA及蛋白表达显著降低(PA细胞、PX细胞、PRZ细胞的平均积分光密度分别为2．21&;#177;0．18，2．09&;#177;0．30。1．45&;#177;0．20)，Bax mRNA和蛋白表达显著增加(PA细胞、PX细胞、PRZ细胞的ABax／Aβ-actin分别为0．17&;#177;0．02，0．23&;#177;0．06，0．59&;#177;0．08)。结论：NHE-1抑制诱导的PASMC凋亡与[Ca^2+]i增加、Bcl-2表达降低及Bax表达增加有关。     

人肺癌细胞转录因子--C/EBP和HMG样蛋白的EMSA检测

目的：检测人肺癌细胞中是否存在与Na^ /H^ 交换蛋白-1（NHE-1）基因转录相关的重要转录因子--C/EBP和HMG样蛋白。方法：采用电泳迁移率改变分析法（EMSA）检测人肺癌细胞株核蛋白中C/EBP和HMG样蛋白的表达及其水平。结果：EMSA检测到A549细胞和转染NHE-1反义载体的A549细胞均有转录因子C/EBP和HMG样蛋白的表达，且后者表达水平高于前者；采用50倍未标记的片段能完全抑制相应转录因子与^32P标记的相同片段的结合。结论：A549细胞核蛋白中存在能与C/EBP结合序列和Poly(dA：dT)区结合的转录因子，即C/EBP和HMG样蛋白，后者的表达水平高于前者。特异性竞争抑制试验表明外源性特异DNA片段能抑制相同片段与转录因子的结合。     

野生型蛋白激酶GIα腺病毒抑制低氧肺动脉平滑肌细胞表型转换及细胞增殖

目的 观察携带野生型蛋白激酶GIα腺病毒(Ad-PKGIα)抑制低氧诱导人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)表型转换及其增殖的影响,探讨其在低氧肺血管重建(HPVR)中的作用.方法 组织块法建立人PASMC细胞系.Ad-PKGIα转染PASMC;采用荧光显微镜观察转染效率;RT-PCR、Western blot检测PASMC中PKGIα mRNA表达、Ad-PKGIα转染对低氧PASMC表型转换中平滑肌α肌动蛋白(SM-α-actin)表达的影响.流式细胞仪检测Ad-PKGIα转染后低氧对PASMC细胞周期的影响;~3H-TdR掺入法检测PASMC增殖.结果 (1)Ad-PKGIα转染后PASMC中PKGIα mRNA水平、磷酸化PKGIα蛋白水平显著增高.(2)常氧时PASMC中SM-α-actin蛋白表达为44.25±5.34;3% O_2处理12 h PASMC中SM-α-actin蛋白表达水平降至32.18±4.19,处理24 h SM-α-actin蛋白表达水平降至21.90±2.44.(3)低氧条件下,PASMC开始增殖,随着低氧时间延长,PASMC增殖逐渐增加,至24 h PASMC增殖最多[(14 924±1491)次/min].与未转染对照组、腺病毒空载体组比较,Ad-PKGIα转染组PASMC增殖明显受到抑制.(4)低氧使未转染对照组和腺病毒空载体组的PASMC进入有丝分裂期,随着低氧时间延长,G_0/G_1期细胞比例逐渐减少,S+G_2/M期细胞比例逐渐增加.Ad-PKGIα转染后常氧状态下PASMC G_0/G_1期细胞比例下降、S+G_2/M期细胞比例上升趋势均明显减缓.结论 PKGIα基因在低氧肺血管重建信号转导途径中有重要的调节作用,可作为基因治疗的靶点之一.     

整合素和粘着斑激酶在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移调控中的作用

目的探讨整合素和粘着斑激酶是否在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）迁移调控中起作用。方法前期实验将JWA核酶基因构建到逆转录病毒载体pLXSN上，转染人体外培养的人PASMCs内，并证实转染的JWA特异性核酶基因能抑制PASMCs内JWA基因的表达。该研究应用改良Boyden小室法测定细胞迁移情况．半定量RT-PCR（sqRT-PCR）法测定细胞内整合素αv、整合素β3。粘着斑激酶的mRNA表达量．Western blot法检测细胞内整合素αv、整合素β3、粘着斑激酶的蛋白表达量。结果与空载体转染细胞（P-pLXSN组）及未转染细胞（PASMCs组）比较．转染JWA核酶基因的细胞（P-JWARZ组）迁移率显著增加，细胞内整合素αv、整合素β3、粘着斑激酶的mRNA及蛋白表达量均显著增加。结论整合素、粘着斑激酶信号通路可能在JWA基因抑制诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移中起调控作用。     

NHE—1的表达、调控与白血病细胞多药耐药

多药耐药（MDR）机制多种多样且往往复合存在。目前发现MDR细胞pHi高于敏感细胞，而Na^ -H^ 交换蛋白－1（NHE－1）是调节pHi的主要离子通道蛋白，故通过抑制NHE－1降低MDR细胞pHi可能成为化疗增敏、逆转MDR的新手段。     

体外转染JWA核酶反转录病毒载体对人肺动脉平滑肌细胞表型及迁移的影响

目的：探讨JWA核酶基因转染对肺动脉平滑肌细胞表型及迁移的影响。 方法：实验于2004-08／2005—04在华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸病研究室完成。质粒pLXSN为第三军医大学附属新桥医院呼吸研究所惠赠。人肺动脉平滑肌细胞（C-12521）及平滑肌细胞生长培养基2（C-22162）购自德国Promo Cell公司。设计合成JWA核酶基因并构建于反转录病毒载体pLXSN上，转染体外培养的人肺动脉平滑肌细胞，经鉴定证实转染成功后，应用半定量反转录聚合酶链反应法测定细胞内JWA mRNA的表达，改良Boyden小室法测定细胞迁移情况，半定量反转录聚合酶链反应法及免疫细胞化学法检测α—SM actin表达量反映细胞表型变化。 结果：转染JWA核酶基因的细胞（P—JWARZ）JWA mRNA表达量较空载体转染细胞（P-pLXSN）及未转染细胞（肺动脉平滑肌细胞）显著降低，细胞迁移率显著增加，α—SM actin表达量显著减少（JWA mRNA：0.5812&;#177;0．0455，0．7823&;#177;0．0292，0．8169&;#177;0．0289；细胞迁移：29．6&;#177;4．72，7．2&;#177;1．44，6．6&;#177;1．92：α—SM actin mRNA：0．4418&;#177;0．0202，0．4767&;#177;0．0209，0．2661&;#177;0．0119；α—SM actin蛋白：0．2211&;#177;0．0093，0．3251&;#177;0．0085，0．3200&;#177;0．0095，P〈0．01）。 结论：JWA核酶基因转染可抑制人肺动脉平滑肌细胞内JWA基因的表达，使细胞分化为合成表型，促进细胞迁移。     

Effects of NHE-1 ribozyme gene transfection on apoptosis of rat pul-monary artery smooth muscle cells in vitro

Objective: To investigate the effects of the transfection of NHE-1 ribozyme gene on the apoptosis of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) in vitro. Methods：After NHE-1 ribozyme gene was de-signed, synthesized and then cloned into plasmid pLXSN, the recombined plasmid was tansfected into cul-tured rat PASMC. Expression of NHE-1 mRNA was detected with semi-quantitative RT-PCR. Intracellular pH (pHi) was measured by using fluorescence dye BCECF-AM. Cell cycle was measured with aid of flow cy-tometric DNA analysis. Cell apoptosis was observed with electron microscopy and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labelling (TUNEL) respectively. Results. The NHE-1 mRNA expres-sion level and pHi value were significantly lower in PASMCs transfected with NHE-1 ribozyme gene than those transfected with pLXSN or without transfection. Meanwhile, the apoptosis rate of cells transfected with NHE-1 ribozyme gene was increased significantly. Morphology of cell apoptosis was observed in the cells transfected with NHE-1 ribozyme gene under an electron microscope. Conclusions The transfection of NHE-1 ribozyme gene induces the apoptosis of PASMCs by inhibiting NHE-1 expression and intracellular acidification.     

全反式维甲酸对人肺动脉平滑肌细胞表型和迁移的影响及可能机制

目的探讨全反式维甲酸(atRA)对培养的人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)表型和迁移的影响及可能机制。方法培养的人PASMC株随机分成8组:对照组(A组)、溶媒组(B组)、10%胎牛血清干预组(C组)、atRA干预组分别加入浓度为0.001μmol/L(D组)、0.01μmol/L(E组)、0.1μmol/L(F组)、1μmol/L(G组)、10μmol/L(H)组的atRA,干预24 h后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞JWA基因mRNA表达,用改良Boyden小室法检测各组迁移细胞数,用RT-PCR法及免疫细胞化学法检测各组细胞内平滑肌细胞α肌动蛋白(SM-α-actin)mRNA及蛋白表达。结果人PASMC内JWA mRNA表达量A、B、C组分别为0.125±0.014、0.164±0.018、0.164±0.006,3组间比较差异无统计学意义(P均>0.05);而D组(0.326±0.018)、E组(0.440±0.033)、F组(0.460±0.040)、G组(0.589±0.024)、H组(0.821±0.050)分别与A、B、C组比较差异均有统计学意义(P均<0.01);迁移细胞数C组为(30.4±7.4)个/高倍视野(HP),与A组[(7.2±1.9)个/HP]、B组(6.8±2.3)个/HP]比较差异有统计学意义(P均<0.01);而D组[(21.8±2.9)个/HP]、E组[(17.2±2.3)个/HP]、F组[(14.4±3.5)个/HP]、G组[(12.6±3.4)个/HP]、H组[(8.8±2.4)个/HP]与C组比较差异有统计学意义(P均<0.01);但G、H组与A、B组比较差异无统计学意义(P均>0.05);细胞内SM-α-actin蛋白表达量C组为0.219±0.018,与A组(0.319±0.011)、B组(0.325±0.005)比较差异均有统计学意义(P均<0.01);E组(0.328±0.016)、F组(0.386±0.025)、G组(0.442±0.017)、H组(0.501±0.018)与C组比较差异均有统计学意义(P均<0.01);而F、G、H组与A、B组比较差异均有统计学意义(P均<0.01);细胞内SM--αactin mRNA表达量C组为0.144±0.009,与A组(0.299±0.023)、B组(0.296±0.041)比较差异有统计学意义(P均<0.01);而D组(0.487±0.014)、E组(0.501±0.020)、F组(0.611±0.018)、G组(0.774±0.013)、H组(0.851±0.026)与A、B、C组比较差异均有统计学意义(P均<0.01)。结论atRA能诱导人PASMCs内JWA基因表达增加,使细胞表现为收缩表型,细胞迁移受到抑制。     

NHE-1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的探讨NHE-1反义RNA对大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMC)凋亡的影响.方法构建NHE-1反义RNA逆转录病毒载体,转染体外培养的大鼠PASMC,应用半定量RT-PCR法(sqRT-PCR)测定细胞内NHE-1 mRNA的表达、BCECF法测定pHi、流式细胞仪测细胞周期、电镜及原位细胞凋亡检测(TUNEL法)观察细胞凋亡情况.结果转染NHE-1反义RNA逆转录病毒载体的细胞,NHE-1 mRNA表达量及pHi较空载体转染细胞及未转染细胞显著降低,细胞凋亡率显著增加,电镜示细胞凋亡,凋亡小体形成.结论抑制NHE-1可通过引起细胞内酸化,诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡.