弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠的体液免疫反应及保护性观察

目的观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗在小鼠体内诱导的体液免疫反应，以及产生的保护性效果。方法P30乳酸球菌口服免疫BAILB／c小鼠，以gp42乳酸球菌组和生理盐水组为对照，4周内免疫7次，免疫结束后，分别收集各组小鼠血清，ELISA法检测血清中总抗体IgG和抗体亚类IgG1和IgG2a水平，同时用100个弓形虫RH株速殖子攻击各实验小鼠。结果P30乳酸球菌口服免疫小鼠组检测到了相应的抗体，抗体亚类IgG2a的生成量稍高于IgG1，两对照组均检测不到明显的相应抗体；攻击后，口服疫苗免疫组平均存活时间多于对照组4d。结论P30乳酸球菌口服疫苗刺激小鼠产生了相应的抗体，诱导产生了偏向Th1型的免疫反应，且在小鼠体内发挥了部分保护作用。     

rhIL—13在毕氏酵母中的表达及生物学活性研究

目的 在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达重组人白介素-13（rhIL-13),便于进一步研究开发。方法 根据酵母对密码子的偏爱性设计并人工合成了人IL-13编码基因片段,经T4DNA连接酶、PCR技术连接形成IL-13cDNA全长序列;将其托入pPICZαA质粒中,构建成pPICZαA-IL-13表达载体。该载体经SacI线形化后以电转化法导入GS115酵母菌株中,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得IL-3表达阳性菌株;用Western Blotting和ELISA检测发酵上清中IL-13的抗原性和表达量,B9-11细胞株分析其生理学活性。结果 15%—SDS-PAGE显示重组人IL-13分子量约13kd,Western-blotting证实为人IL-13,ELISA测定在摇瓶培养上清表达量达15ug/ml,其生物学活性同标准品一样具有剂量依赖性的刺激B9-11细胞株增殖的作用。结论 成功获得IL-13人工基因和稳定分泌蛋白的基因工程菌株。该重组蛋白的生物学活性达到标准品的要求。     

弓形虫GRA6可溶性蛋白在大肠埃希菌中的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中高效表达及纯化弓形虫GRA6抗原,为制作弓形虫感染基因工程诊断试剂盒奠定基础.方法将重组pGEX-GRA6表达载体转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus（DE3）-RP菌株,在异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）诱导下表达.超声破壁后,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析表达产物的表达形式,并对表达产物以硫酸铵沉淀、Sephedax G50脱盐和GST亲和层析柱进行目的蛋白的纯化.通过Western blotting检测其纯化的重组抗原的免疫反应性.结果GRA6以融合蛋白（GST-GRA6）的形式在大肠埃希菌中得到了高效表达.对表达产物可溶性分析表明,表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达.在上清液中表达的可溶性蛋白经纯化后蛋白纯度可达90%以上.Western blotting分析表明纯化蛋白能被弓形虫感染的人血清所识别.结论GRA6在大肠埃希菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化后能特异性地被弓形虫感染者血清所识别.     

弓形虫P30乳酸球菌口服免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-2及NO含量的测定

目的 观察弓形虫P30乳酸球菌（L．1actis／P30）口服免疫鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-2及NO的变化情况。方法 L．1actis／P30口服免疫BAI。B／c小鼠，以gp42乳酸球菌组和生理盐水组为对照，在第3周、第9周及第12周分别收集各实验组小鼠血清，ELISA法测定血清IFN-γ、IL-2含量；酶法测定N0浓度。结果L．1actis／P30i21服免疫鼠血清中IFN-γ，IL-2含量均显著高于两对照组，血清中N0含量随着免疫时间延长与两对照组差异逐渐明显。结论 L．1actis／P30口服免疫能有效刺激小鼠细胞因子IFN7和IL2的产生及N0分子的释放。     

乳酸乳球菌表达弓形虫棒状体蛋白1(ROP1)

目的　在乳酸乳球菌中表达ROP1抗原蛋白。方法　从质粒 psk -ROP1中以BamHⅠ和SalⅠ双酶切出ROP1基因 ,置换构建好的大肠杆菌 -乳酸乳球菌穿梭表达质粒L2 -PsP30T中的P30基因 ,电转化感受态乳酸乳球菌 ,以Westernblotting鉴定ROP1在乳酸乳球菌中的表达。结果　表达产物中有一约 4 3kDa的蛋白带能被弓形虫病人血清识别。结论　ROP1在乳酸乳球菌中得到了表达     

弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗诱导小鼠的体液免疫反应及保护性观察

目的观察弓形虫P30乳酸球菌口服疫苗在小鼠体内诱导的体液免疫反应,以及产生的保护性效果. 方法P30乳酸球菌口服免疫BALB/c小鼠,以gp42乳酸球菌组和生理盐水组为对照,4周内免疫7次,免疫结束后,分别收集各组小鼠血清,ELISA法检测血清中总抗体IgG和抗体亚类IgG1和IgG2a水平,同时用100个弓形虫RH株速殖子攻击各实验小鼠. 结果 P30乳酸球菌口服免疫小鼠组检测到了相应的抗体,抗体亚类IgG2a的生成量稍高于IgG1,两对照组均检测不到明显的相应抗体;攻击后,口服疫苗免疫组平均存活时间多于对照组4 d. 结论 P30乳酸球菌口服疫苗刺激小鼠产生了相应的抗体,诱导产生了偏向Th1型的免疫反应,且在小鼠体内发挥了部分保护作用.     

重组人Flt3配体在毕氏酵母中的表达及其对恶性造血细胞的体外作用

目的 用毕氏酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达人可溶性Ｆｌｔ３配体（ｒｈＦＬ）,并观察ｒｈＦＬ对恶性造血细胞增殖的作用;探讨地塞米松（ＤＸＭ）对Ｆｌｔ３受体（Ｆｌｔ３Ｒ）表达及ｒｈＦＬ介导的恶性造血细胞增殖的影响。方法 人工合成ＦＬ基因片段,经基因重组技术获得重组质粒ｐＰＩＣＺα－ＦＬ,电转化毕氏酵母,筛选分泌ｒｈＦＬ的基因工程菌株,用流式细胞仪测定恶性造血细胞表面Ｆｌｔ３Ｒ的表达,用ＭＴ     

碱性脂肪酶同工酶的分离纯化

对经疏水层析 (PhenylSepharoseCL 4L)和阴离子交换层析 (DEAE FastFlow)等部分纯化的样品 ,采用制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步将其分离纯化 ,获得了PG3 7碱性脂肪酶的 3种同工酶LipaseⅠ、LipaseⅡ和LipaseⅢ .用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和SephadexG 1 50凝胶色谱法分别测得同工酶的相对分子质量为 2 750 0和 2 90 0 0 .测定了LipaseⅠ的等电点为 5.4 ,动力学常数Km 和Vmax分别为 4 .54g/dL和 5.56μmol/ (min·μg) .     

复式PCR检测疟原虫的应用研究

[目的 ]建立适合于疟疾流行区现场应用的复式 PCR检测系统。 [方法 ]采用生理盐水处理样本 ,设计针对恶性疟原虫 (P.f) p BPK1- 14基因和间日疟原虫 (P.v)线粒体细胞色素 C氧化酶基因 CO 合成引物 ,混合一次扩增检测P.f 和 P.v。[结果 ]P.f 及 P.v模板分别被扩增出一条 2 10 bp和 370 bp的片段 ,与食蟹猴疟原虫 (P.c)、鼠伯氏疟原虫(P.b)及正常人白细胞无交叉 ,且可检测不同地理株的 P.f 和 P.v,P.f 和 P.v的敏感度分别为 5 .5× 10 - 7和 1.5×10 - 6 ,检测 146份疟区发热病人 ,与镜检结果相比 ,其敏感性和特异性 P.f为 97.9%和 98.7% ,P.v为 10 0 %和 98.7%。[结论 ]该复式 PCR检测系统适应于现场疟疾流行病学监测 ,防治效果考核 ,疑似疟疾病人的诊断及虫种鉴定。     

rhIL-13在毕氏酵母中的表达及生物学活性研究

目的　在甲醇营养型毕氏酵母蛋白质表达系统中高效表达重组人白介素-13（rhIL-13）,便于进一步研究开发。方法　根据酵母对密码子的偏爱性设计并人工合成了人IL-13编码基因片段,经T4DNA连接酶、PCR技术连接形成IL-13cDNA全长序列;将其插入pPICZαA质粒中,构建成pPICZαA-IL-13表达载体;该载体经SacI线形化后以电转化法导入GS115酵母菌株中,经YPD平板Zeocine抗性筛选获得IL-13表达阳性菌株;用Western Blotting和ELISA检测发酵上清中IL-13的抗原性和表达量,B