rVvhA诱导小鼠单核巨噬细胞凋亡的作用及其机制

目的 研究重组创伤弧菌溶细胞素(rVvhA)诱导小鼠单核巨噬细胞(J774A.1)凋亡的作用及机制.方法 MTT法、电子透射电镜、流式细胞仪结合Annexin V-PI标记法、线粒体膜电位和cagpase活性检测等方法测定rVvhA诱导J774A.1凋亡的作用.结果 MTT结果显示rVvhA能够抑制J774A.1生长.2.0溶血单位(HU)/ml和3.0 HU/ml的rVvhA作用J774A.18 h后,透射电镜观察细胞和线粒体形态发生凋亡改变;流式细胞仪检测凋亡率分别为(7.80±0.62)%、(12.33±0.12)%,均高于正常组(3.07±0.67)%;线粒体膜电位也下降,流式细胞仪结果显示绿色荧光率分别是9.8%、39.2%.其中3.0 HU/ml rVvhA作用组,caspage-3、9活性增加,并且具有时间依赖性,而cagpage-8活性没有明显改变.3.0HU/ml rVvhA加caspage-3抑制剂(Ac-DEVD-FMK)或caspase-9抑制剂(Ac-LEHD-FMK)的凋亡率与3.0 HU/ml rVvhA作用组相比都降低,分别为(6.23±3.95)%、(9.60±3.14)%;同时cagpage-3、9活性也下降.结论 rVvhA具有诱导J774A.1凋亡的生物学活性;其机制可能与依赖cagpase的线粒体途径有关.     

眼源性蜡样芽孢杆菌vrrA基因型及其与病情和预后关系

目的建立PCR检测眼源性蜡样芽孢杆菌,了解不同vrrA基因型蜡样芽孢杆菌感染与临床病情和预后关系。方法选择vrrA为靶基因设计引物,建立检测蜡样芽胞杆菌PCR。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测并进行序列测定。采用Clustal 软件对获得的vrrA基因序列进行分型。对不同vrrA基因型蜡样芽胞杆菌感染与眼内炎患者病情严重程度及转归分析与比较。结果所建立的PCR可有效检测眼源性蜡样芽胞杆菌并有较高的敏感性和特异性。5株分离自眼内炎患者标本中的蜡样芽胞杆菌可分为MT1、MT2、MT3三种vrrA基因型,其中MT1、MT2型各2株,MT3型1株。MT1和MT2型蜡样芽胞杆菌感染性眼内炎病情重、预后差,MT3型蜡样芽胞杆菌感染性眼内炎病情较轻、预后较好。结论vrrA基因为靶基因的PCR可用于眼源性蜡样芽孢杆菌快速检测。不同蜡样芽孢杆菌vrrA基因型感染所致的眼内炎病情严重程度及转归有明显差异。     

眼源性蜡样芽孢杆菌溶血素BL及其体外生物活性检测

目的 对经API细菌鉴定条所证实的眼源性蜡样芽孢杆菌进行溶血素BL(HBL)基因鉴定并进行体外毒理性试验.方法 根据溶血素结合亚基B、2个溶血亚基L1、L2三种组分的基因核苷酸序列,设计合成3对特异性引物,通过体系和条件优化,建立PCR检测方法,并对5株临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌进行检测分析;随机选取其中1株菌,利用盐析法提取溶血素,并以不同浓度剂量作用于绵羊红细胞、Vero细胞和Hela细胞,监测其对细胞的毒性;通过腹腔注射观察HBL对小鼠的致死作用,评估其毒力的强弱.结果 5株临床分离菌中,共检出3个基因;蜡样芽孢杆菌溶血素BL蛋白具有较强溶血活性,其溶血活性呈明显的时间-剂量依赖性;BL溶血素对Vero细胞和Hela细胞的作用所致的形态变化虽有不同,但结果均导致细胞死亡,其内容物释出;对小鼠的致死率同样存在时间-剂量依赖性,且2.0 HU/ml浓度以上的BL溶血素可使小鼠48 h的致死率达100％.结论 HBL具有较强的溶血活性,对临床分离的眼源性蜡样芽孢杆菌BL基因进行检测,3个基因均表达,为该菌感染后病情发展迅速、预后较差的临床表现提供了理论依据,同时为该病的快速诊断和分子流行病学调查提供了新的方法.