狂犬病病毒HEP-Flury-mEG株的拯救与鉴定

目的拯救狂犬病毒HEP-Flury-mEG株,为疫苗制备奠定基础。方法将ERA株G蛋白333位毒力位点修饰为谷氨酸后替换至HEP-Flury株基因组。重组感染性克隆质粒和4个辅助质粒,共转染BHK-21细胞,拯救重组病毒。结果 IFA鉴定成功拯救出了HEP-Flury-mEG株狂犬病病毒。重组病毒G基因经XholⅠ酶切,片段大小为1 071bp和520bp,与预期结果相符。重组病毒在BHK-21细胞中传代4次,滴度维持在1×107.5 FFU/ml。重组病毒经常规负染后在电镜下为弹状粒子,长度和直径与亲本株一致。结论获得了重组狂犬病毒HEP-Flury-mEG株。该病毒滴度高,形态完整,传代稳定,为进一步研究狂犬病毒病毒的生物学特性和新型基因工程疫苗奠定了基础。     

DG01株HSN1亚型禽流感病毒全基因组序列分析

根据国内外已公布的AIVH5N1亚型全基因组序列设计了8对引物，对H5N1亚型高致病力禽流感病毒毒株A／Duck／Guangdong／DG01／05（简称DG01）毒株进行了全基因组RT-PCR、测序及序列分析。DG01株基因组由PB22341bp，PB1 2341bp，PA2 233bp，HA1 779bp。NP1 565bp，NA1 398bp，M1 027bp。NS 875bp8个节段组成，与往年及同年一些流行株比较分析结果显示。DG01株具有高致病性禽流感病毒基因特征，NA基因及NS1基因均有部分缺失，从基因特点分析属于2005年流行代表株。     

狂犬病毒新型快速荧光斑点抑制实验方法的建立

目的建立一种新型的快速荧光斑点抑制实验用于狂犬病毒抗体的检测。方法本研究以携带绿色荧光蛋白基因的嵌合狂犬病毒HEP-GFP株为基础毒株,建立了一种新型快速荧光斑点抑制实验(RFFIT-GFP);并对多份人、犬、猫的血清进行了检测,还将该检测结果与传统的RFFIT,ELISA相比较。结果与结论RFFIT-GFP和RFFIT,ELISA测定的结果基本相一致,特异性都比较高,而且RFFIT-GFP是一种比它们更为简便、经济的检测方法。     

广东地区大肠杆菌O157∶H7的分离与鉴定

目的了解广东地区家畜、肉菜市场及屠宰场中动物、动物源性食品原材料中大肠杆菌O157H7的分布及这些细菌对常用抗菌素的敏感性。了解这些细菌对小白鼠的致病力。方法样品采集送实验室后,接种mEC+n肉汤培养基中于41℃增菌24h,取增菌液接种CTSMAC平板,37℃培养24h,挑取可疑菌落,经血清学检验、微量生化实验初步确认。再用5重PCR对它们进行基因检测确认。然后在小白鼠中进行毒性试验;用药敏试纸测试它们对常用抗菌素的敏感性。结果共检查猪、牛粪便、猪肉样品及肝肺拭子样品共774份,检出4株O157H7,检出率052%;对分离菌株作药物试验,发现菌株对四株素,链霉素、青霉素、磺胺类等存在不同程度的耐药。结论我们首次对广东省作O157H7较全面的调查,分离出4株O157H7。     

腺病毒载体及其在狂犬病疫苗研究中的应用

疫苗是目前人类可以彻底控制某一传染性疾病的唯一武器,预防接种不但保护了个体免受传染病病原体的侵袭,而且在群体中也限制了病原微生物的传播.     

多重PCR方法检测大肠杆菌O157:H7的初步研究

目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157：H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157：H7的O157抗原基因（rfbE基因）、鞭毛H7抗原基因（fliC基因）、粘附素基因（eaeA基因）和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因）为扩增对象，设计能导至目的片段大小不同的5对引物，通过优化条件，建立了可用于粪便检测的大肠杆菌5重PCR。结果在同一扩增体系中，检测了5株不同来源的大肠杆菌O157：H7及27株非大肠杆菌O157：H7细菌。结果表明，该方法能从2株大肠杆菌O157：H7中扩增出rfbE、fliC、eaeA、SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因，它们的大小分别为582bp、802bp、487bp、368bp和177bp。而另外3株大肠杆菌O157：H7也能扩增出除eaeA、SLT-Ⅱ基因外的其它3个基因片段。表明该方法可用于检测大肠杆菌O157：H7，还可检测细菌是否含有毒素基因。在检测27株非大肠杆菌O157：H7．除O149出现SLT-Ⅱ扩增产物和01：H7出现flic基因扩增产物外，其它非大肠杆菌O157：H7的扩增结果均为阴性，表明该方法有较高的特异性。当粪便样品经增菌培养12h，用该5重PCR体系能检测出最初接种量为5cfu／g粪便的样品。结论本5重PCR方法具有较高的特异性和敏感性，可迅速、有效地将大肠杆菌O157：H7与其它非大肠杆菌O157：H7相区别，同时还能检测O157：H7中的毒力因子。因此，通过进一步研究，本方法有望应用于临床大肠杆菌O157：H7感染的辅助诊断。     

狂犬病毒HEP-dG株的拯救

目的筛选免疫原性高、致病性低的狂犬病疫苗候选株。方法应用反向遗传技术,在狂犬病毒弱毒株HEP-Flury株全基因组3'-N-P-M-G-L-5'的假基因区域(G与L之间),插入一个G基因,构建携带双G基因的全长感染性克隆,其与辅助质粒共转染BHK-21细胞,盲传十代,用荧光抗体和RT-PCR鉴定病毒。结果成功获得携带双G基因的狂犬病毒HEP-dG株,该病毒在BHK-21细胞中稳定生长,其病毒滴度达到1010FFU/mL。结论HEP-dG株会为研制高效的狂犬病病毒基因工程口服疫苗提供了良好的疫苗候选株。     

狂犬病病毒HEP-Flury M基因重排在小鼠致病性和保护性研究

目的 了解M基因重排对病毒致病性和免疫保护性的影响,从而为狂犬病疫苗的开发提供更适合的候选株。方法 将病毒rHEP-Flury和M基因重排株颅内接种1～3 d龄的乳鼠,测定病毒在乳鼠上的半数致死量(LD₅₀)。将rHEP-Flury和M基因重排株以10³、10⁴和10⁵ FFU免疫接种6~8周龄的成鼠,然后用标准攻毒株CVS-24进行颅内感染小鼠,测定小鼠的存活率。同时用ELISA方法检测小鼠血清抗体水平。结果 狂犬病病毒HEP-Flury的M基因重排后,病毒对乳鼠的毒力随着M基因位置远离病毒启动子位置增强,即M24和10⁵FFU时,M基因重排对病毒在成鼠上的保护性没有统计学意义影响;当接种剂量为10³FFU时,M基因重排病毒对小鼠的保护性明显高于rHEP-Flury。结论 狂犬病病毒HEP-Flury的M基因重排能够降低病毒对乳鼠的毒力,提高对小鼠的保护性,为狂犬病疫苗开发奠定基础。     

DG01株H5N1亚型禽流感病毒全基因组序列分析

根据国内外已公布的AIV H5N1亚型全基因组序列设计了8对引物,对H5N1亚型高致病力禽流感病毒毒株A/Duck/Guangdong/DG01/05(简称DG01)毒株进行了全基因组RT-PCR、测序及序列分析。DG01株基因组由PB22 341bp,PB1 2 341bp,PA2 233bp,HA1 779bp,NP 1 565bp,NA1 398 bp,M1 027bp,NS 875 bp 8个节段组成,与往年及同年一些流行株比较分析结果显示,DG01株具有高致病性禽流感病毒基因特征,NA基因及NS1基因均有部分缺失,从基因特点分析属于2005年流行代表株。     

猪狂犬病的确证

目的 了解广东省某一猪场发生狂犬病猪只的感染状况。方法 采集疑似狂犬病发病猪的大脑、小脑以及海马回,制成切片,用姬姆沙染色,在光学显微镜下检测狂犬病病毒包涵体。用抗狂犬病病毒N蛋白荧光抗体染色,在荧光显微镜下检测特异荧光。用蛋白酶K处理病料,抽提核酸,以狂犬病病毒N基因特异引物作RT-PCR检测狂犬病病毒特异性核酸。将病料接种小白鼠接毒,观察小鼠的发病。结果 病理学切片检测病猪脑海马神经细胞中有包涵体;脑组织印片经特异性抗狂犬病病毒核蛋白(NP)单克隆抗体免疫荧光染色后,荧光显微镜下可见大量的针尖状绿色荧光颗粒;狂犬病病毒NP特异性目的基因RT-PCR得到与预期结果大小一致的扩增产物;小白鼠接毒试验,3日龄以内乳鼠接毒后出现特异性的神经症状。结论 该猪场病死猪检测狂犬病病毒感染阳性,确定猪群中发生狂犬病。