中国恒河猴(Macaca mulatta)外周血CD4+CD25+T淋巴细胞的研究

目的:研究中国恒河猴外周血中CD4 CD25 T淋巴细胞亚群及其分布频率。方法:利用流式细胞术对50只中国恒河猴外周血CD4 CD25 T淋巴细胞进行了分析。结果:发现所有被检测的恒河猴个体中均存在明显的CD4 CD25 T淋巴细胞亚群;CD4 CD25 T淋巴细胞大约占CD4 T淋巴细胞的9.1%(变化范围为2.6%～18.1%);其中CD4 CD25highT淋巴细胞约占2.5%(0.3%～5.5%)。对不同年龄和性别个体中CD4 CD25 T淋巴细胞频率的初步分析未发现统计学上有年龄或性别差异。结论:中国恒河猴可用于与CD4 CD25 T细胞相关的人类疾病的研究中。     

中国HIV-1 CRF01_AE流行株结构基因和调节/辅助基因DNA疫苗的构建和免疫原性研究

目的 构建表达gag-env融合基因和tat-rev-integrase(c-holf)-vif-nef融合基因的DNA疫苗,并评价其免疫原性.方法 按人源密码子使用频率对AE2f株的gag、env、tat、rev、integrase、vif和nef基因序列进行优化,构建真核表达质粒.用Western blot法验证体外表达情况;用ELISPOT法检测小鼠的细胞免疫反应.结果 限制性酶切及DNA测序结果表明两个融合基因质粒构建正确,可以表达相应的融合蛋白.ELISPOT结果显示,Gag-Env特异性的T细胞反应强度为(3010±566)SFC/10~6脾细胞;Tat-Rev-Integrase(C-half)-Vif-Nef融合蛋白特异性的T细胞反应为(948±737)SFC/10~6脾细胞,均显著高于空载体组.结论 构建的表达HIV-1 CRF01_AE流行株gag-env融合基因和tat-rev-integrase(c-half)-vif-nef融合基因的DNA疫苗可以正确表达所编码的融合蛋白并有效地激活机体的T细胞免疫反应.     

中国恒河猴(Macaca mulatta)外周血Th17细胞及其在SHIV感染后的变化

目的: 对正常中国恒河猴(Macaca mulatta)及嵌合猿猴/人免疫缺陷病毒(SHIV)感染过的中国恒河猴外周血中CD4 IL-17A 和CD4-IL-17A T淋巴细胞的分布频率进行初步观察.方法: 用荧光染料标记的单克隆抗体(mAb)对10只中国恒河猴的外周血或PMA Ionomycin刺激后的PBMC细胞表面的CD3、 CD4、 CD8及细胞内IL-17A进行免疫荧光染色.用FACScalibaur获取染色后的样品, 所得数据用CellQuest进行分析.结果: 在6只正常中国恒河猴个体中均能检测到IL-17A 淋巴细胞, 未经刺激培养的样品中IL-17A 细胞频率很低, 但在短期刺激培养后淋巴细胞中具有约1.4%的淋巴细胞为IL-17A 细胞, 明显多于刺激前的IL-17A 淋巴细胞; 在短期刺激培养后CD3 CD4 淋巴细胞中大约有2.7%的IL-17A 细胞或CD4 Th17细胞.对4只SHIV感染个体中Th17细胞的初步分析未发现它们与正常个体间的统计学差异.结论: 与人类相似, 中国恒河猴的外周血中也存在一定比例的Th17细胞, 为进一步利用恒河猴AIDS动物模型分析HIV/AIDS与Th17细胞的关系提供了基础.     

CpG-ODN7909与X射线辐射对人肺腺癌A549细胞的协同治疗作用

放疗是恶性肿瘤的重要治疗措施之一,但肿瘤细胞自身对放射线的抗拒性往往导致放疗失败,寻找行之有效的放射增敏剂是多年来肿瘤研究领域倍受关注的热点.含非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤的寡聚核苷酸序列(CpG-oligodeoxynucleotidea,CpG-0DN),能被脊椎动物的树突状(DC)细胞和B淋巴细胞内Toll样受体9(toll like receptor 9,TLR9)识别,通过下游的信号级联反应,产生多种细胞因子,激活机体的免疫系统[1].     

ELISpot 分析技术发展、实验标准化及应用进展

1983年,澳大利亚和瑞士2个研究小组先后报道ELISpot技术.此后的20多年中,ELISpot技术不断发展,并逐渐标准化.近年来因其具有简便、特异、敏感的优点,被广泛应用于疫苗、癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病以及过敏性疾病的研究之中[1],并在科学研究和临床应用方面发挥着极其重要的作用.     

新加坡诺氏疟原虫警报

我们报告1例在新加坡这个从来一个没有疟疾的国家发现了自然感染诺氏疟原虫的病例。确认诊断使用经过验证的特异性引物的PCR（聚合酶链式反应）的方法。在工业化的国家，自由放养的灵长类动物是人感染诺式疟原虫的潜在来源，在新加坡诺式疟原虫的感染需要与发热疾病进行鉴别诊断。     

不同感染时间与感染途径的HIV-1感染者全基因组CTL免疫反应比较研究

目的 分析研究不同感染时间和不同途径感染HIV/AIDS感染者覆盖全基因组的CTL应答特征.方法 将75例HIV/AIDS感染者分为3组,血液感染1～2年组(10例)、血液感染＞10年组(43例)和性接触感染1～2年组(22例);以HIV-1 B亚型构建全基因组17个肽库作为抗原,采用ELISpot检测各组HIV特异性CTL应答;采用流式细胞术检测各组CD4计数;采用实时定量RT-PCR检测各组HIV病毒载量.结果 血液感染1～2年组、血液感染＞10年组和性接触感染1～2年组感染者对HIV-B亚型17个肽库的平均应答频率分别为40%、65%、23%,经单向方差分析,3组感染者对HIV-1 B亚型17个肽库的应答频率差异有统计学意义(F=19.96,P＜0.01);3组感染者对HIV-B亚型17个肽库总应答强度范围分别为0～5 835 SFCs/106 PBMC、0～7 225 SFCs/106PBMC、0～9 740 SFCs/106PBMC,且3组感染者对HIV-B亚型17个肽库的应答强度差异亦有统计学意义(H=101.90,P＜0.01);此外,3组感染者对HIV-1 B亚型17个肽库的应答广度分别为7(2～11)个、11(9～14)个、4(2～6)个,3组感染者应答广度的差异也有统计学意义(H=34.75,P＜0.01).3组感染者应答频率、应答强度和应答广度从高到低依次为血液感染＞10年组、血液感染1～2年组、性接触感染1～2年组.不同感染时间和不同感染途径的感染者对Nef肽库和Gag肽库的应答百分比和应答强度均高于其他肽库.CD4计数＜200/μl、CD4计数为200～500/μl和≥500/μl3组感染者对17个肽库的总应答强度范围分别为0～18 475 SFCs/106 PBMC、350～34 095 SFCs/106PBMC、490～21 550 SFCs/106 PBMC,但差异无统计学意义(H=2.93,P=0.23);3组感染者CTL应答广度分别为3(0～8)个、10(2～17)个、10(1～17)个,3组间差异有统计学意义(H=14.72,P＜0.01),CD4计数＜200/μl的感染者CTL应答广度低于CD4计数为200～500/μl和≥500/μl组.不同病毒载量3组(＜LDL、LDL-1×104拷贝/ml和≥1×104拷贝/ml)标本对17个肽库的总应答强度范围分别为490～18 475 SFCs/106PBMC、0～24 115 SFCs/106PBMC、770～34 095 SFCs/106 PBMC,但3组间差异无统计学意义(H=0.79,P=0.67);应答广度分别为8(1～17)个、11(0～17)个、8(1～16)个,3组间差异也无统计学意义(H=5.27,P=0.07).结论 中国HIV/AIDS感染者中CTL应答多集中在Nef和Gag,这两个抗原为HIV/AIDS感染的优势抗原;感染时间和感染途径对CTL应答可产生显著影响;随感染时间的延长,免疫反应的强度与应答比例均增加.这些信息对设计针对中国人群的AIDS疫苗有较重要意义.

Abstract：

Objective To investigate and compare the features of the HIV-1-specific CTL responses among three HIV-infected groups with varied infection history. Methods Three HIV-infeeted groups were enrolled in this study, including two groups infected by blood transmission (one group has been infected for more than 10 years and the other for 1-2 years) and one group of the man who have sex with man. The HIV-1-specific CTL responses were quantified by an IFN-γ based ELISPot assay with a peptide matrix system containing overlapping peptides spanning the entire HIV-1 Clade B genomic consensus sequences. Results The responding rate of CTL responses against all 17 peptide pools among the group that infected 1-2 years,the group infected more than 10 years and the group of MSM were 40% ,65% ,23%. One way ANOVO analysis showed that the responding rate of CTL responses against all 17 peptide pools were statistical significant among the three groups (F=19.96, P＜0.01);the magnitude of CTL responses of the three groups were 0-5 835 SFCs/106 PBMC, 0-7 225 SFCs/106PBMC, 0-9 740SFCs/106pBMC, Kruskal-Wallis test showed that the magnitude of CTL responses were statistical significant among the three groups( H = 101.90 , P ＜0.01);the breadth of CTL were 7 ( 2-11 ), 11(9-14) and 4 (2-6) respectively and Kruskal- Wallis test showed that the breadth of CTL had no statistical significant among the three groups( H = 34. 75 ,P ＜0. 01 ). The sequence of responding rate, magnitude and breadth of CTL from high to low was the group that had been infected for more than 10 years, the group infected 1-2 years and the sex transmission group. The common characteristics of the CTL response among the three groups were that the responding rate and the magnitude of the peptide Nef and Gag was higher than other peptide's. The magnitude of CTL responses among three different CD4count groups (CD4 ＜ 200/μl, CD4 200-500/μl, CD4 ≥500/μl,) was 0-18 475 SFCs/106pBMC, 350-34 095 SFCs/106pBMC, 490-21 550 SFCs/106 PBMC and had no statistic difference among the three different CD4 groups(H=2.93, P=0.23) while the breadth of CTL was 3(0-8), 10(2-17), 10 (1-17)respoctively and the breadth of CTL was lower in the group of CD4 count less than 200/μl than the other two groups( H = 14. 72, P ＜ 0. 01 ). The magnitude of CTL responses among three different viral load (VL)groups (VL＜ LDL, LDL ＜ VL ＜ 1 × 104 copys/ml, VL≥1 ×104 copys/ml) was 490-18 475 SFCs/106pBMC, 0-24 115 SFCs/106pBMC, 770-34 095 SFCs/106 pBMC and had no statistic difference among the three different viral load groups ( H = 0.79, P=0.67) and the breadth of the three different viral load groups CTL was 8( 1-17), 11 (0-17), 8 (1-16) and Kruskal-Wallis test showed that there was no statistic difference among the three different viral load groups (H =5.27, P =0. 07). Conclusions All groups predominantly develope T cell immune responses against Nef and Gag proteins. With the elapse of HIV infection, the CTL responses are increased in both magnitude and responding rate. This information is important for vaccine development.     

乙型肝炎相关肝癌患者乙型肝炎病毒不同抗原肽特异性CD3+CD8+人白细胞抗原-A2+细胞表达

目的 探讨乙型肝炎相关肝细胞癌(HCC)患者外周血单个核细胞(PBMC)中HBV不同抗原肽特异性CD3+ CD8+人白细胞抗原( HLA)-A2+细胞的表达.方法 从4例HLA-A2阳性乙型肝炎相关HCC患者外周血中分离PBMC,分别与HBV抗原肽sAg( FLLTRILTI、GLSPTVWLSV、WLSLLVPFV),HBV eore(FLPSDFFPSV)和HBV pol(FLLSLGIHL)及抗-CD3-pacific blue、抗-CD8-异硫氰酸荧光素共育,流式细胞仪分析HBV/HLA-A2-CD3-CD8阳性细胞,克隆培养,筛选出克隆培养的抗HBV T淋巴细胞;再与含有HBV的肝癌细胞株HepG2( HLA-A2+)共育,ELISA法检测其分泌IFN-γ水平.结果 4例患者体内受GLSPTVWLSV肽诱导的特异性抗HBV T淋巴细胞占所有CD8+细胞的1.44％±0.04％,高于FLLTRILTI肽的0.68％±0.08％、FLPSDFFPSV肽的1.06％±0.09％、FLLSLGIHL肽的0.56％±0.04％和WLSLLVPFV肽的0.46％±0.08％(t=0.001,P＜0.05).将GLSPTVWLSV/HLA-A2获得的HBV/HLA-A2 PentamerCD3-CD8阳性细胞克隆,获得2株抗HBV CD8 T淋巴细胞,与负荷GLSPTVWLSV肽段的HepG2 (HLA-A2+)细胞共育,CD8 T淋巴细胞分泌较高水平的IFN-γ.结论 乙型肝炎相关HCC患者外周血中存在针对不同HBV抗原肽的特异性抗HBV CD8 T淋巴细胞,其表达量与抗原肽段有关.     

不同黏膜上皮细胞中巨噬细胞炎性蛋白-3α转录水平的荧光定量RT-PCR比较分析

目的 定量比较分析不同黏膜上皮细胞中人巨噬细胞炎性蛋白-3α(MIP-3α)的转录水平.方法 体外转录制备MIP-3α RNA标准品,人工合成MIP-3α mRNA序列特异的引物及TaqMan探针.利用TaqMan EZ RT-PCR试剂盒的反应体系和ABI实时荧光定量PCR仪进行实时荧光定量RT-PCR.通过对RT-PCR产物测序、使用标准品和质控品进行多次独立测试等评估实时荧光定量RT-PCR方法的特异性、灵敏度和可重复性.随后对不同黏膜上皮细胞系Caco-2、T-84、HeLa和淋巴细胞系PM1中MIP-3α mRNA水平进行了定量检测.结果 建立了可用于MIP-3α mRNA水平定量检测的实时荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性好(扩增片段测序结果与参考序列完全一致)、灵敏度高(25 μl反应体系中有5个拷贝就可以检出)、检测样品浓度范围广(103～1010拷贝/ml).对Caco-2、T-84、HeLa和PM1细胞中MIP-3α mRNA水平的定量分析表明,肠黏膜上皮细胞Caco-2和T-84的MIP-3α mRNA水平比HeLa和PM1细胞高.结论 黏膜上皮细胞能表达丰富的MIP-3α,不同黏膜上皮细胞MIP-3α的表达水平可能不同.     

HIV-1潜伏感染人Jurkat T细胞模型的建立

目的 建立Ⅰ型艾滋病病毒(HIV-1)潜伏感染人Jurkat T细胞的模型,为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定基础.方法 利用一种表达增强型绿色荧光蛋白( EGFP)的HIV-1假病毒感染人Jurkat T细胞,采用流式细胞术分选出GFP -细胞群,之后经激活剂曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA...