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目的研究γ干扰素(IFN-γ)活化的THPI源巨噬细胞对BCG的杀伤作用,并探讨其杀伤机制是否与自噬有关。方法Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA,也称佛波酯)诱导THP-1分化成巨噬细胞。牛分枝杆菌减毒株荧光BCG以感染复数MOI(multiplicityofinfection,细菌数与细胞数的比例)10:1感染未活化(Control组)、IFN7活化(IFN-γ组)、Rapamycin诱导自噬(Rapa组)、3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬(IFN-γ+3-MA组)4组不同预处理的巨噬细胞。感染48h后,超纯水裂解细胞,收集裂解液和培养上清混合,相同比例取各组混合液10μl,连续10倍稀释3次涂7H10平板培养基,置37℃生化培养箱培养,第3至4周观察记录菌落数,计算生存率Econtrol组的菌落数为分母,其他组(包括control组)的菌落数为分子相除得到的数值为生存率]。同时在感染过程的不同时间点裂解细胞提取总蛋白,以Westernblot方法检测自噬标志蛋白LC3B的表达,监测细胞自噬水平的变化。实验结果数据以3次重复实验数据的“x±s”形式展示(Westernblot结果除外,只采用其中-个结果数据为代表)。用SPSS17.0软件进行统计分析:巨噬细胞贴壁率比较和凋亡率比较用两独立样本t检验;巨噬细胞活化后不同时间点分泌的TNF-α浓度比较和BCG感染各组巨噬细胞后的生存率比较用One-WayANOVA检验,以P〈0.05为差异有统计学意义。结果BCG感染各组巨噬细胞48h后的生存率:Control组为(100%±0%),IFN7组(45Yo±3%),Rapa组(48%±3%),IFN-γ+3-MA组(91%±2%)。BCG生存率经One-WayANOVA检验,与Control组(未活化组)比较:IFN-γ组BCG生存率明显下降(P=0.01),细胞自噬水平明显增高;Rapa组BCG生存率明显下降(P=0.01),细胞自噬水平明显增高;IFN-γ+3MA组BCG生存率无下降(P=0.13),细胞自噬水平无增高。结论BCG感染巨噬细胞,或者说巨噬细胞吞噬BCG,两者的相互作用微妙而复杂。巨噬细胞在IFN7活化期间遭遇BCG,可以明显杀伤BCG,杀伤机制与自噬有关。 相似文献
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目的 克隆结核分枝杆菌Rv3803c和Rv3846基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中进行表达和纯化。 方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增出Rv3803c和Rv3846基因片段,克隆至pGEX-6P-1表达载体中,测序正确后,在E.coli Rosetta中诱导表达,GST标签亲和层析法纯化蛋白,考马斯亮蓝染色及Western-blot分析鉴定。 结果 重组质粒pGEX-Rv3803c、pGEX-Rv3846测序表明核苷酸序列与设计完全一致。其在E.coli Rosetta中的存在形式均为可溶部分约50%、包涵体约50%,相对分子质量约为56 000和45 000, 纯化的GST-Rv3803c、GST-Rv3846样品纯度90%以上。完整的GST-Rv3803c的浓度大约为0.1 mg/ml,完整的GST-Rv3846的浓度大约为0.5 mg/ml。即相当于每升E.coli Rosetta培养物中,GST-Rv3803c产量为:0.25 mg/L、GST-Rv3846产量为1.25 mg/L。 结论 成功获得了纯化蛋白Rv3803c(MPT51)和Rv3846(SodA),为进一步研究MPT 51和SodA蛋白的辅助诊断价值、构建保护性疫苗提供了实验依据。 相似文献
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