γ干扰素活化的THP-1源巨噬细胞杀伤荧光BCG的实验研究

目的研究γ干扰素（IFN-γ）活化的THPI源巨噬细胞对BCG的杀伤作用,并探讨其杀伤机制是否与自噬有关。方法Phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA,也称佛波酯）诱导THP-1分化成巨噬细胞。牛分枝杆菌减毒株荧光BCG以感染复数MOI（multiplicityofinfection,细菌数与细胞数的比例）10：1感染未活化（Control组）、IFN7活化（IFN-γ组）、Rapamycin诱导自噬（Rapa组）、3-甲基腺嘌呤（3-MA）抑制自噬（IFN-γ＋3-MA组）4组不同预处理的巨噬细胞。感染48h后,超纯水裂解细胞,收集裂解液和培养上清混合,相同比例取各组混合液10μl,连续10倍稀释3次涂7H10平板培养基,置37℃生化培养箱培养,第3至4周观察记录菌落数,计算生存率Econtrol组的菌落数为分母,其他组（包括control组）的菌落数为分子相除得到的数值为生存率]。同时在感染过程的不同时间点裂解细胞提取总蛋白,以Westernblot方法检测自噬标志蛋白LC3B的表达,监测细胞自噬水平的变化。实验结果数据以3次重复实验数据的“x±s”形式展示（Westernblot结果除外,只采用其中-个结果数据为代表）。用SPSS17．0软件进行统计分析：巨噬细胞贴壁率比较和凋亡率比较用两独立样本t检验;巨噬细胞活化后不同时间点分泌的TNF-α浓度比较和BCG感染各组巨噬细胞后的生存率比较用One-WayANOVA检验,以P〈0．05为差异有统计学意义。结果BCG感染各组巨噬细胞48h后的生存率：Control组为（100％±0％）,IFN7组（45Yo±3％）,Rapa组（48％±3％）,IFN-γ＋3-MA组（91％±2％）。BCG生存率经One-WayANOVA检验,与Control组（未活化组）比较：IFN-γ组BCG生存率明显下降（P=0．01）,细胞自噬水平明显增高;Rapa组BCG生存率明显下降（P=0．01）,细胞自噬水平明显增高;IFN-γ＋3MA组BCG生存率无下降（P=0．13）,细胞自噬水平无增高。结论BCG感染巨噬细胞,或者说巨噬细胞吞噬BCG,两者的相互作用微妙而复杂。巨噬细胞在IFN7活化期间遭遇BCG,可以明显杀伤BCG,杀伤机制与自噬有关。     

热灭活和紫外线照射灭活结核分枝杆菌的实验效果分析

我国卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》中结核分枝杆菌被列为第二类病原微生物（危害程度为Ⅲ级）,属高致病性病原微生物[1]。实验室研究课题中,大部分涉及到结核分枝杆菌的操作,实验室生物安全是首先要解决的问题。至今,已有一些关于实验室工作人员患结核病的报道,其中呼吸道吸入感染是实验室感染的最主要类型[2]。     

结核分枝杆菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表达、纯化与鉴定

目的 克隆结核分枝杆菌Rv3803c和Rv3846基因,并在大肠埃希菌(E.coli)中进行表达和纯化。 方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增出Rv3803c和Rv3846基因片段,克隆至pGEX-6P-1表达载体中,测序正确后,在E.coli Rosetta中诱导表达,GST标签亲和层析法纯化蛋白,考马斯亮蓝染色及Western-blot分析鉴定。 结果 重组质粒pGEX-Rv3803c、pGEX-Rv3846测序表明核苷酸序列与设计完全一致。其在E.coli Rosetta中的存在形式均为可溶部分约50%、包涵体约50%,相对分子质量约为56 000和45 000, 纯化的GST-Rv3803c、GST-Rv3846样品纯度90%以上。完整的GST-Rv3803c的浓度大约为0.1 mg/ml,完整的GST-Rv3846的浓度大约为0.5 mg/ml。即相当于每升E.coli Rosetta培养物中,GST-Rv3803c产量为：0.25 mg/L、GST-Rv3846产量为1.25 mg/L。 结论 成功获得了纯化蛋白Rv3803c（MPT51）和Rv3846（SodA）,为进一步研究MPT 51和SodA蛋白的辅助诊断价值、构建保护性疫苗提供了实验依据。