生长素诱导的蛋白敲减系统在刚地弓形虫Chinese 1虫株中的应用及验证

目的应用生长素诱导的蛋白敲减(AID)系统调控刚地弓形虫Chinese 1虫株中荧光蛋白的表达。方法人工合成3′端融合有标签FLAG的植物生长素受体--运输抑制剂响应蛋白1(TIR1)的核苷酸序列TIR1-FLAG,将其连接至pTub-e GFP-CAT载体中,构建pTub-TIR1-FLAG-CAT表达质粒;表达质粒经电穿孔转染至弓形虫Chinese 1虫株TgCtwh3,经氯霉素筛选和极限稀释后筛选单克隆虫株。PCR扩增及蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测单克隆虫株中TIR1基因的插入和相应蛋白的表达,将验证正确的阳性克隆命名为TIR1虫株。构建表达荧光蛋白mCherry-Ty-AID报告基因的表达质粒pTub-mCherry-Ty-AID-DHFR,并通过电穿孔转染将其整合至TIR1虫株基因组中,乙胺嘧啶筛选后极限稀释筛选获得稳定表达mCherry-AID的虫株,命名为TIR1:m Cherry-AID虫株。将TIR1:mCherry-AID虫株的虫体分为吲哚乙酸(IAA)调控组和对照组,IAA调控组加IAA至终浓度500μmol/L,对照组加等量乙醇,培养3 h后,分别以抗TgGAP45和抗Ty-1抗体为一抗,间接免疫荧光试验(IFA)和Western blotting分析IAA调控下mCherry荧光蛋白的表达情况。结果PCR扩增结果显示,在1816 bp处有一条特异性扩增条带。Western blotting分析结果显示,抗FLAG-Tag抗体可识别TIR1虫株中相对分子质量(Mr)约70000的蛋白;Ty-1抗体可在TIR1:mCherry-AID虫株的对照组中检测到约Mr58000的特异性条带,与理论上C端融合了AID的mCherry-Ty蛋白大小相同;在IAA调控组中未检测到特异性条带。IFA结果显示,TIR1:mCherry-AID虫株对照组可见红色荧光蛋白,IAA调控组未检测到mCherry蛋白。结论应用AID系统可成功调控弓形虫Chinses 1虫株中mCherry荧光蛋白的表达。     

刚地弓形虫TgPRF的原核表达、多克隆抗体制备与应用

目的 原核表达弓形虫TgPRF蛋白,制备多克隆抗体并评价其作为内参抗体的可行性。方法 以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgPRF编码基因,克隆至pGEX-4T-1载体,转化至大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。利用GST标签亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化后蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗TgPRF多克隆抗体。收集弓形虫RH株速殖子,以制备的多克隆抗体为一抗,Western blotting检测抗体特异性及效价。收集ATc调控下不同时间点的弓形虫iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子进行Western blotting,以抗Ty和抗TgPRF抗体为一抗,检测TgAPH和TgPRF表达量的变化。结果 SDS-PAGE显示：TgPRF在诱导4 h后表达量趋于饱和,相对分子量为52 ku,且呈可溶性表达。弓形虫RH株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示：抗TgPRF多克隆抗体可识别内源性的TgPRF,且该多克隆抗体稀释至1∶10 000时仍可见明显条带;iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示：TgAPH的表达量随ATc作用时间的增加呈递减趋势,而TgPRF表达量基本维持恒定。结论 本实验制备的抗TgPRF多克隆抗体特异性和效价良好,可作为衡量弓形虫特定蛋白表达量的内参抗体,也可直接检测内源性TgPRF的表达。     

抗伊氏锥虫VAT兔源“抗体库”的建立及其抗虫效果检测

将编号为01,02,03,04,05的5个伊氏锥虫克隆群体以107条/只的剂量经耳静脉分别接种至1只新西兰大白兔体内,免疫荧光试验检测抗体滴度达到最高后,开始耳静脉采血提取抗血清。之后每隔2天提取一次抗血清,每只共提取10次,5只共50份血清等量(各占1/50)混合,称为抗活体锥虫血清“抗体库B”;此外取BeTat1·1,BeTat1·2……BeTat1·19,BeTat1·20共计20个抗原变异体以107条/只的剂量经耳静脉分别接种至1只新西兰大白兔体内,免疫荧光试验检测抗体滴度达到最高后,一次心脏采血,分离血清,20只共20份血清等量(各占1/20)混合,称为抗活体锥虫血清“抗体库A”;取编号为01的伊氏锥虫克隆群体以100条/只的剂量腹腔注射分别接种小鼠和大鼠,镜检见虫后使用抗活体锥虫血清“抗体库B”和抗活体锥虫血清“抗体库A”分别进行治疗。结果显示“抗体库B”治疗组的小鼠保护率为93·75%,大鼠的保护率达到了100%,“抗体库A”的治疗效果则不明显。     

12例脑并殖吸虫病临床特点分析

目的探讨脑并殖吸虫病的临床特征、实验室检查和影像学特点,为临床医师提供更加丰富的医学资料。方法收集并分析首都医科大学附属北京友谊医院在2011年1月—2017年10月收治确诊的12例脑并殖吸虫病患者的病例资料。结果脑并殖吸虫病的主要临床表现是头痛、癫痫发作和颅内出血,12例患者均有明确的流行病学史。9例患者并殖吸虫抗体Ig G呈现阳性;8例患者外周血嗜酸粒细胞升高;7例患者颅内压增高;7例患者脑脊液蛋白升高;8例患者脑脊液中WBC及嗜酸性粒细胞数升高;7例患者脑脊液总Ig G升高;头颅MR见所有患者表现为多发病灶,9例患者病灶位于枕叶,具有多发环状特征,10例T1加权成像,11例T2加权成像表现为高信号,病灶周围伴有水肿带,3例患者有颅内出血征象。12例患者使用吡喹酮治疗均达到临床治愈标准。结论本文通过系统总结12例脑并殖吸虫病患者的流行病学史、临床表现和实验室检查结果,为临床医师对该病的诊治提供依据。     

刚地弓形虫TgPH1蛋白的重组表达及其与磷脂酰肌醇结合性的鉴定

目的 鉴定重组刚地弓形虫TgPH1蛋白与磷脂酰肌醇在体外的相互结合作用。方法 提取刚地弓形虫总RNA,经RT-PCR扩增TgPH1基因编码序列。扩增产物连接入原核表达载体pGEX-4T-1中得到载体pGEX-TgPH1。同时通过基因定点突变获得载体pGEX-TgPH1R37H。将测序正确的以上两种载体分别转化至大肠埃希菌（E. coli）BL21(DE3) 并用IPTG诱导表达;SDS-PAGE结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。重组蛋白经亲和层析纯化后,利用PIP Strips脂质膜免疫印迹试验检测重组蛋白与不同磷脂酰肌醇的结合。结果 经IPTG诱导4 h后,具有载体pGEX-TgPH1或pGEX-TgPH1R37H的菌株,在相对分子量接近40 kD处出现一条清晰的外源蛋白条带。纯化的重组GST-TgPH1蛋白能与PI3P和PI(3,5)P2特异性结合;而其相应的突变体GST-TgPH1R37H蛋白并不与膜上的任何磷脂酰肌醇分子相结合。结论 本研究获得了弓形虫PH1全长重组蛋白,并鉴定了其与磷脂酰肌醇在体外的相互结合作用;同时表明TgPH1蛋白中R37位碱性氨基酸残基对其与磷脂酰肌醇的识别和结合过程中起着关键性的作用。本研究为进一步探索具有PH功能域的蛋白及与不同磷脂酰肌醇相互作用的分子机理研究奠定了基础。     

内脏利什曼病死亡病例的临床分析

目的了解内脏利什曼病死亡病例的临床特点及实验室指标变化特征。方法分析北京友谊医院2013年1月—2018年6月4例内脏利什曼病死亡患者的临床资料,比较患者实验室指标的差异。结果 4例内脏利什曼病患者的病程3～12个月,患者均出现了多脏器的损伤,其中3例肝、脾大,2例出现中枢神经系统的损伤。4例患者利什曼原虫IgG抗体为阳性,骨髓涂片中均找到了利杜体。4例患者外周血常规的三系明显降低,清蛋白明显降低,球蛋白升高;4例患者的血清钠离子含量低于135 mmol/L。结论内脏利什曼病患者出现病程长,多脏器损伤,累及中枢神经系统,外周血常规三系显著降低,低蛋白血症,以及低钠血症均提示预后差,病死率高。     

恶性疟原虫自噬相关蛋白8基因原核重组表达及多克隆抗体制备

目的 通过pET-41 Ek/LIC载体在大肠杆菌工程菌中重组表达恶性疟原虫自噬相关蛋白8（PfAtg8）基因的重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,并用蛋白免疫法制备小鼠抗自噬相关蛋白8（PfAtg8）的多克隆抗体,并验证其效价。 方法 体外培养恶性疟原虫3D7株,并提取DNA,PCR扩增PfAtg8序列全长,与pET-41 Ek/LIC载体通过基因重组直接连接,在大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）PLysS工程菌中诱导表达重组蛋白GST-PfAtg8-6×His,蛋白免疫法制备鼠抗PfAtg8的多克隆抗体并用Western blots和酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）进行效价验证。 结果 PCR扩增PfAtg8基因并插入pET-41 Ek/LIC载体,转化入大肠杆菌。诱导表达并纯化重组蛋白,进而利用该蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,经验证该抗体可对重组蛋白进行特异性识别,且效价可达1∶100 000。结论 成功表达、纯化了GST-PfAtg8-6×His重组蛋白,并免疫小鼠获得多克隆抗体血清。     

顶复门原虫运动、入侵和逸出相关分子机制研究进展

顶复门原虫,包括疟原虫和弓形虫等,具有一个名为滑行体的特殊运动结构专职于虫体的运动、入侵和从感染的细胞中逸出。虫体的滑行运动遵从严格的时空调控,以确保感染的建立。在多种肌动球蛋白的共同作用下,滑行体某些结构将虫体内的能量进行转化,使虫体能够改变运动方向,定向运动至有利于入侵的位置。滑行体依附于虫体的细胞骨架,并通过与虫体分泌的黏附分子与宿主膜表面受体形成紧密结合,在虫体和宿主细胞之间形成一条方便虫体入侵的“通道”,确保入侵的顺利进行。本综述将介绍滑行体的分子组成,虫体的多种分泌蛋白（微线体蛋白和棒状体蛋白）与滑行体之间的关系,本文还介绍了近些年来国内外在入侵和逸出相关的信号通路领域的研究进展。此外,对顶复门原虫运动机制领域研究中的未解难题进行了总结。     

寄生虫病分子生物学诊断进展

随着全球生态变化和人口流动频繁,寄生虫病的感染情况不容乐观。目前实验室开展的寄生虫病原学和免疫学检测方法仍存在一些不足,因此以分子生物学为检测手段的寄生虫病精准诊断,将更有利于推动寄生虫病的诊断水平。本文对目前的原虫、蠕虫相关病原体的分子生物学检测作一综述。     

疟原虫和弓形虫的自噬作用研究进展

自噬（autophagy）是一种十分保守且普遍存在于真核细胞的代谢途径。虽然原生生物的自噬具有很多特殊性,但随着近年来对酵母和哺乳动物自噬机制的深入研究,顶复门原虫（Apicomplexa）的代表性生物疟原虫（Plasmodium）和弓形虫（Toxoplasma gondii）的自噬研究也取得了一定进展。疟原虫和弓形虫能够进行经典的自噬代谢,也涉及一种和顶质体相关的非典型代谢机制。在顶复门原虫中也发现了许多经典的自噬相关蛋白,其在自噬代谢途径中的功能和分子机制受到广泛关注。本文重点对疟原虫和弓形虫的自噬研究进展进行综述。