标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量测定

目的研制粉尘螨Ⅱ组变应原Der f 2单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb),并建立双单抗夹心ELISA检测方法 ,测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f 2的含量。方法应用基因工程方法获得粉尘螨变应原Der f2重组蛋白并通过亲和层析纯化,再免疫小鼠,利用间接ELISA筛选获得McAb杂交瘤细胞株并纯化、鉴定抗体的特异性;用一株单抗包被酶标板,同时用生物素标记另一株单抗,从而建立双单抗体夹心ELISA法;并用此法测定粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量。结果成功地获得了一株单抗3B12与屋尘螨抗原具有交叉反应,另外一株单抗3G7与屋尘螨抗原没有交叉反应,并建立了双单抗夹心ELISA方法测定Der f2的含量,其方法的检测限为0.5ng/mL,并在6.25ng/mL-300ng/mL范围内线性良好;标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中Der f2的含量为100ng/10000BAU。结论成功制备了高效价抗Der f 2单抗,并建立了双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有很高的灵敏度,可以测定标准化粉尘螨变应原脱敏疫苗中主要变应原Der f 2含量,为临床应用奠定基础。     

粉尘螨过敏原Der f15的表达、纯化和生物信息学分析

目的表达纯化出粉尘螨过敏原Der f15蛋白,并预测其三维结构及B细胞抗原表位。方法利用实验室已有的Der f15质粒转化到大肠杆菌Rosetta,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过亲和层析纯化蛋白,经免疫印迹法(Western-blot)分析Der f15免疫原性,用生物信息学方法分析Der f15的三维结构及B细胞抗原表位。结果高效表达出Der f15蛋白。SDS-PAGE结果显示:表达的产物分子量约107ku。经亲和层析成功纯化蛋白,纯化蛋白以尘螨过敏患者血清为一抗进行Western-blot,结果显示:Der f15重组蛋白能与患者血清IgE发生特异性结合,而阴性对照没有反应条带出现,表明Der f15具有良好的抗原性。对B细胞抗原表位的预测表明,Der f15蛋白的第20~35、121~131、340~359及485~500是潜在B细胞抗原表位。结论粉尘螨Der f15表达、纯化和生物信息学分析研究有助于了解Der f15蛋白的分子生物学特性,为粉尘螨过敏反应性疾病的特异性诊断和疫苗治疗奠定理论基础。 更多还原     

粉尘螨铁蛋白的克隆、表达及蛋白特征分析

目的 为了获得粉尘螨铁蛋白(ferritin)蛋白,并对该蛋白特征进行分析。方法 根据铁蛋白基因已知序列,设计出相应的引物,提取粉尘螨总RNA,采用RT-PCR方法扩增出铁蛋白基因,PCR产物克隆入pET32a载体,构建的重组质粒pET32a-ferritin,经酶切和测序鉴定后,再转化至大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定其表达效果,用Ni⁺离子亲和层析柱纯化其重组蛋白。用生物信息学方法对粉尘螨铁蛋白的特征进行分析。结果 成功克隆粉尘螨铁蛋白基因并构建了pET32a-ferritin重组质粒;粉尘螨铁蛋白基因开放阅读框为543 bp,编码179个氨基酸,PI 5.35;SDS-PAGE结果表明铁蛋白基因在大肠杆菌 Bl21(DE3)中获得良好的表达,经亲和层析纯化后, 表达产物分子质量约为20 kD。经生物信息学分析, 粉尘螨铁蛋白含有8个丝氨酸激酶、7个苏氨酸激酶、7个酪氨酸激酶、0组氨酸激酶磷酸化位点,亲水区域大于疏水区域,属不稳定蛋白。结论 克隆、表达了尘螨铁蛋白,经纯化后获得较高纯度的重组蛋白,并对其三级结构进行分析,为进一步研究尘螨过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础。     

口虾蛄原肌球蛋白基因表达及变应原性鉴定

目的克隆口虾蛄原肌球蛋白(tropomyosin)基因并表达纯化出重组蛋白,研究其变应原性。方法提取口虾蛄总RNA,设计特异引物,通过反转录聚合酶链反应克隆出目的基因片段,测序后将该片段克隆到原核表达载体pET-28a上,转化到E.coliBL21(DE3)后,经异丙基-B-D-硫代乳糖苷(IPTG)诱导表达,用Ni²⁺亲和层析柱对重组变应原进行纯化。采用免疫印迹(Western-blot)检测其与对虾过敏的患者血清IgE结合活性。结果经序列测定,该基因含有长度为855bp的开放阅读框,编码284个氨基酸(GenBank登录号为EF584510)。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该重组变应原在大肠埃希菌中高效表达36kDa的目的蛋白,且重组变应原具有良好的IgE结合活性。结论本研究成功获得了具有变应原活性的重组口虾蛄原肌球蛋白。