狂犬病病毒HEP-Flury-mEG株的拯救与鉴定

目的拯救狂犬病毒HEP-Flury-mEG株,为疫苗制备奠定基础。方法将ERA株G蛋白333位毒力位点修饰为谷氨酸后替换至HEP-Flury株基因组。重组感染性克隆质粒和4个辅助质粒,共转染BHK-21细胞,拯救重组病毒。结果 IFA鉴定成功拯救出了HEP-Flury-mEG株狂犬病病毒。重组病毒G基因经XholⅠ酶切,片段大小为1 071bp和520bp,与预期结果相符。重组病毒在BHK-21细胞中传代4次,滴度维持在1×107.5 FFU/ml。重组病毒经常规负染后在电镜下为弹状粒子,长度和直径与亲本株一致。结论获得了重组狂犬病毒HEP-Flury-mEG株。该病毒滴度高,形态完整,传代稳定,为进一步研究狂犬病毒病毒的生物学特性和新型基因工程疫苗奠定了基础。     

裂谷热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立一种快速、敏感、特异的RealtimePCR（实时荧光定量PCR）方法,用于裂谷热病毒（RVFV）的检测。方法根据裂符热病毒N蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行Real-timePCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的Real-timePCR方法检测裂谷热病毒所绘制标准曲线的相关系数大于0．99,灵敏度为1．0×10^1拷贝,高于常规PCR方法（1．0×10^3拷贝）;除裂谷热病毒外的其他7种对照烈性病病原体基因检测均呈阴性;批内重复和批问重复的变异系数均小于1％。结论建立的裂谷热病毒Real-timePCR检测方法敏感性和特异性较高,可用于裂谷执病毒感染懊涑诊眯斤殛流行病学谰杏．     

埃博拉病毒VP40蛋白的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立北大核心CSCD

目的以埃博拉病毒(EBOV)VP40基因原核表达产物为抗原建立检测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法。方法在分析EBOV VP40基因稀有密码子(大肠埃希菌系统)的基础上去除5′和3′端稀有密码子,合成VP40基因,构建VP40蛋白原核表达载体pET22b-VP40,并转化至BL21(DE3)菌,在1.0mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化蛋白为抗原,建立检测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法。结果成功构建重组质粒pET22b(+)-VP40,表达的VP40蛋白经SDS-PAGE鉴定分子质量单位为40ku,与预期值相符;Western blot检测证实VP40重组蛋白能被抗VP40单克隆抗体识别。以该蛋白为包被抗原建立监测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法,其敏感性和特异性均为100%。结论成功构建了pET22b(+)-VP的重组质粒,并诱导表达VP40蛋白。该蛋白具有免疫反应性,以该蛋白为抗原建立的ELISA方法具有较高的特异性和稳定性,可用于埃博拉出血热的诊断和流行病学调查。