肝细胞内人类次要组织相容性抗原-HA8蛋白反式激活基因的筛选

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选肝细胞内人类次要组织相容性抗原-HA8(HLA-HA8)的反式激活基因。方法以HLA-HA8基因表达质粒pcDNA3.1(-)-HLA-HA8和空载体pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞,提取mRNA并反转录合成双链cDNA(dscDNA),分别标记为Tester和Driver;经RsaI酶切后,将Tester cDNA分成两组,分别与两种不同的接头adapter 1和adapter 2衔接,再与Driver cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与pGEM-T easy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建HLA-HA8反式激活基因差异表达cDNA消减文库。扩增后得到101个阳性克隆,菌落PCR分析均得到200~1000bp的插入片段。随机挑选其中28个阳性片段测序,同源分析结果显示,共获得16种编码基因,其中4个功能未知。结论 HLA-HA8基因反式调节基因与细胞结构和生长、物质及能量代谢、物质转运和信号转导密切相关,为HLA-HA8的功能以及HBV感染慢性化机制研究提供了新的思路。     

HCV p7蛋白反式调节基因p7TP2的克隆化及生物信息学分析

目的:克隆HCV p7蛋白反式调节未知功能新基因p7TP2,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能．方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的 cDNA扩增p7TP2基因,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体 pcDNATM3．1／myc-His A,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质、蛋白质结构域、功能及染色体定位．结果:成功从HepG2细胞提取的cDNA中扩增出p7TP2基因,编码区为495核苷酸(nt),编码产物为164氨基酸残基(aa),经核苷酸序列数据库(GenBank)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,属于未知功能新基因,并成功进行TA克隆,酶切、测序均正确,并进一步亚克隆至pcDNATM3．1／ myc-His A真核表达载体,生物信息学分析此基因位于8q24．3,Mr17 146．5,理论pI:9．26,半衰期为30 h(体外哺乳类网状细胞),属于不稳定蛋白,疏水指数较高,含有潜在的三个螺旋区域,四个β折叠,四个蛋白激酶C磷酸化位点, 一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个N-肉豆蔻酰位点,预测可能为具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及两个跨膜结构域．结论:发现了HCV p7反式调节新的靶基因, 构建了pcDNATM3．1／myc-HisA真核表达载体．     

转化生长因子β_1刺激肝星状细胞差异表达下调基因筛选

目的筛选并克隆转化生长因子β1(TGF-β1)刺激肝星状细胞差异表达下调基因,阐明TGF-β1导致肝纤维化的分子生物学机制。方法以TGF-β1及磷酸盐缓冲液分别刺激大鼠肝星状细胞(即实验组和对照组),提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将对照组细胞cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与实验组细胞cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建了TGF-β1刺激肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到98个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。选取含有插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得了19种已知基因序列和2个未知功能基因。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF-β1刺激的肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明TGF-β1参与肝纤维化的分子生物学机制提供了理论依据。     

转化生长因子β1活化肝星状细胞反式激活新基因剪切体的功能

目的 探讨反式激活新基因剪切体TTG 1 A的生物学功能和参与肝纤维化的致病机制.方法 应用酵母双杂交系统3,将PCR扩增的TTG1A基因与酵母表达载体pGBKT7连接,转化酵母细胞AH109,并在其内表达,而后与转化了人白细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经Bgl Ⅱ酶切后测序,进行生物信息学分析. 结果成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTGlA.应用酵母双杂交系统3从人白细胞文库中筛选出19个与TTGlA相互作用的蛋白,其中包括人类主要组织相容性复合物Ⅱ型DP D(HLA-DP β),人类核糖体蛋白L30、人类核磷蛋白B23、人类核组蛋白2、人类ash2、人类变异的家族性睥性贫血和变异的异染性脑白质营养不良相关蛋白,人类死亡因子4(MORF4L1)、人类遍在蛋白偶连酶E2L3、人类载脂蛋白A-1(APOA1)、人类半乳凝素1以及5个未知功能蛋白. 结论 成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTGlA,初步揭示了新基因TTGlA的生物学功能,为进一步研究TGF β1介导的肝纤维化分子发病机制中的作用提供基础.     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg蛋白结合蛋白E36的上调基因

目的应用酵母双杂交及生物信息学(bioinformatics)技术获得HBeAg蛋白结合蛋白HBEBP36(E36),为了解该基因的反式调节机制,利用抑制性消减杂交技术筛选并克隆E36蛋白反式激活的靶基因。方法E36基因表达质粒pcDNA3·1/myc-his(A)(-)-E36转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3·1/myc-his(A)(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应,将产物与pGEM-TEasy载体连接,构建cDNA消减文库,转化大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选30个克隆进行测序及同源性分析。结果成功构建人E36基因反式激活基因差异表达的cDNA消减文库。随机挑选的30个克隆测序后得到27个序列,它们代表17种编码基因,包括ATP合酶、ADP/ATP转运体、NADH脱氢酶、乳酸脱氢酶、核糖体蛋白L23、核糖体蛋白S21、核糖体蛋白L2、胰岛素样生长因子结合蛋白6、甲基转移酶类似物7A、CD46抗原、间质抗原2、转录激活因子4、真核转录延伸因子1α、人微管蛋白α、肌动蛋白α,和2个未知片段。结论E36上调HepG2细胞中的17种基因,它们参与能量代谢、蛋白合成、免疫功能调节等生理过程。     

应用抑制性消减杂交技术筛选转化生长因子β1刺激LX02细胞的反式调节基因

目的 构建转化生长因子(TGF)β1刺激大鼠肝星状细胞(LX02)反式调节基因的cDNA消减文库,筛选并克隆TGF β1反式调节相关基因,以阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制.方法 以TGF β1刺激LX02细胞,同时以磷酸盐缓冲液刺激的LX02细胞作为对照.提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应.将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增;随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到146个200～1000bp插入片段的阳性克隆;随机挑取其中35个克隆进行测序,30个列序成功,并通过生物信息学分析发现有28个与已知基因序列和2个与未知功能基因序列高度同源.结论 应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF β1刺激LX02细胞反式调节基因的cDNA消减文库,筛选到一些与细胞生长调节、蛋白质合成,信号传导、细胞外基质代谢、扰脂质过氧化等密切相关的蛋白质编码基因,为进一步阐明TGF β1介导肝纤维化的分子生物学机制提供了线索.     

乙型肝炎病毒e抗原及DNA载量对慢性乙型重型肝炎预后的影响

目的探讨乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)阳性、阴性及乙型肝炎病毒(HBV)DNA载量对慢性乙型重型肝炎预后的影响。方法回顾性分析2002年7月至2004年12月在北京地坛医院住院的慢性乙型重型肝炎患者206例,以HBeAg阳性、阴性及HBV DNA载量和其他可能影响预后的因素做单因素分析和多因素分析。结果 x2单因素分析显示HBeAg阳性、阴性对慢性乙型重型肝炎预后无影响(x2=0．440,OR=0．777,95％ CI 0．424～1．425,P=0．50),HBV DNA载量对预后影响显著,HBV DNA低载量组和高载量组,好转率分别为53．1％和27．O％(x2=9．806,OR=3．055,95％ CI 1．554～6．007,P=0．002)。经Logistic多元回归分析筛选出肝硬化,肝肾综合征,肝性脑病,凝血酶原时间活动度<20％,总胆红素>513μmol／L,白蛋白<30 g／L, 总胆固醇<1．6 mmol／L,血小板<5×109／L和较高载量HBV DNA(HBeAg阴性者>3×104拷贝／ml,HBeAg 阳性者>1×105拷贝／ml)等9个因子对慢性乙型重型肝炎预后有重大影响,回归系数分别是1．539、21．356、 1．398、1．650、2．440、2．266、1．738、2．631和2．656。其中HBV DNA载量对预后影响的回归系数为2．656, Wald值为7．768,P=0．005,回归系数期望值为14．235,期望值95．O％ CI为2．199～92．133。提示HBV DNA 载量在其他重要因子存在时仍是影响慢性乙型重型肝炎预后的重要因子,其重要程度仅次于肝肾综合征及Ⅱ度以上肝性脑病。结论HBeAg阳性、阴性对慢性乙型重型肝炎预后无影响,HBV DNA载量为预测慢性乙型重型肝炎预后的重要因子,HBV DNA低载量者预后较好。     

HBeAg结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆化

目的:克隆HBeAg结合蛋白未知功能新基因 HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能．方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的cDNA扩增HBeBP4基因的剪切体基因 HBeBP4A,选用pGEM-Teasy载体进行TA 克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体 pcDNATM3．1/myc-HisA,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质,蛋白质结构和功能．结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因,命名为HBeBP4A．利用生物信息学分析推定其 ORF为1104个核苷酸(nt),编码产物为367个氨基酸残基(aa)．结论:发现了HBeAg结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pcDNATM3．1／ myc-HisA真核表达载体．     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白5基因的克隆化研究

目的克隆乙型肝炎病毒（HBV）前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5的cDNA,并应用生物信息学技术初步探讨其结构及功能。方法应用聚合酶链反应（PCR）技术以HepG2细胞的cDNA为模板扩增PSlTP5,以pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体pcDNA^TM 3．1／myc-His A,通过PCR、限制性酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学技术初步分析其物理化学性质、蛋白质结构和功能。结果PCR成功扩增出PS1TP5基因,并将其分别克隆进pGEM-T和pcDNA^TM3．1／myc-HisA载体,经PCR、限制性酶切鉴定后测序证实。因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白5（PS1TP5）,已在GenBank中注册,注册号：AY427953。生物信息学分析确定其ORF为438个核苷酸（nt）,编码产物为145个氨基酸残基（aa）。结论发现了HBV前-S1蛋白反式激活新基因PS1TP5,构建了pcDNA^TM 3．1／myc-His A真核表达载体,为进一步研究其生物学功能及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆与原核表达

目的:克隆乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其原核表达载体,诱导在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及生物信息学(bioinformat-ics)技术从HepG2细胞提取的cDNA模板中扩增获得HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-T-easy载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,转化进BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导HBeBP4A融合蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析鉴定证实表达蛋白的特异性。结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因HBeBP4A,并将其插入pET-32a( )原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了HBeBP4A重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论:发现了乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pET-32a( )-HBeBP4A原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a( )-HBeBP4A重组蛋白的表达。