α7神经型尼古丁受体激动剂PNU282987对APP/PS1小鼠海马组织中DYN-Ⅰ蛋白表达的影响

目的研究特异性激动APP/PS1转基因小鼠脑组织中α7神经型尼古丁受体(α7 nAChR)水平后对海马组织DYN-Ⅰ蛋白的影响;探讨α7 nAChR在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)发病机制中的神经保护作用机制。方法实验动物分为对照组(Control)、野生加PNU282987组(WP)、APP/PS1转基因组(APP/PS1)和APP/PS1加PNU282987组(AP)各8只,WP和AP组给予α7 nAChRs特异性激动剂PNU-282987,另两组给予生理盐水,给药方式为小鼠24 w龄时1 mg/kg腹腔注射PNU-282987,连续5 d。采用Real-time PCR法和蛋白免疫印迹(Western Blot)法分别测定小鼠海马组织中发动蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ)mRNA和蛋白表达水平的变化。结果与control组相比,APP/PS1组海马组织中发动蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ)mRNA和蛋白水平下降(P0.05,P0.01);而特异性激动α7 nAChR水平后,与对照组相比WP组中发动蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ)mRNA和蛋白水平升高(P0.05,P0.01);与APP/PS1组相比AP组小鼠大脑海马组织中发动蛋白Ⅰ(DYN-Ⅰ)mRNA和蛋白水平明显升高(P0.01,P0.01)。结论特异性激动APP/PS1转基因小鼠海马组织中α7 nAChR水平能够使网格蛋白内吞调节蛋白DYN-Ⅰ表达升高。这可能提示了α7 nAChR对突触有一定的保护作用,进一步说明α7 nAChR在阿尔茨海默病的发病中起着重要作用。     

慢性氟中毒大鼠脑组织中Nrf2和HO1蛋白表达

目的：观察慢性氟中毒时大鼠脑组织中核因子E2相关因子2（nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2）和血红素氧合酶1（heme oxygenase-1,HO1）蛋白水平表达改变,探讨氟中毒性脑损伤机制.方法：SD大鼠90只,随机分为正常对照组、染氟组及维生素E（VitE）拮抗组,实验期10个月;观察氟斑牙情况,用氟离子选择电极法测定大鼠尿氟及骨氟含量,用免疫组织化学方法检测脑组织中Nrf2和HO1蛋白表达.结果：染氟组和VitE拮抗组大鼠出现不同程度的氟斑牙,染氟组重于VitE拮抗组,差异有统计学意义（P＜0.05）;染氟组与VitE拮抗组大鼠尿氟和骨氟含量均高于对照组,染氟组高于VitE拮抗组,差异有统计学意义（P＜0.05）;免疫组化显示染氟组和VitE拮抗组大鼠脑组织中Nrf2及HO1阳性表达较对照组升高,VitE拮抗组升高程度不如染氟组,差异都有统计学意义（P＜0.05）.结论：慢性氟中毒可导致脑组织中Nrf2及HO1表达水平升高,增强细胞抗氧化能力,可能与慢性氟中毒脑损伤的机制有关.     

α7神经型尼古丁受体激动剂PNU282987对小鼠海马组织突触相关蛋白的影响

目的探讨特异性激动小鼠α7神经型尼古丁受体(α7n AChR)水平对海马组织中突触相关蛋白表达的影响。方法选取6月龄非转基因C57雄性小鼠32只,随机分为对照组(Control),腹腔注射0.5、1.0 mg/kg、3.0 mg/kg PNU282987组各8只。采用Real-time PCR法和蛋白免疫印迹(Western印迹)法分别测定小鼠海马组织中囊泡相关蛋白突触素(Syn)、突触小体相关蛋白(SNAP)-25和突触后致密物(PSD)-95 mRNA及蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比,1.0 mg/kg PNU282987组、3.0 mg/kg PNU282987组中突触相关蛋白Syn、PSD-95、SNAP-25的mRNA和蛋白表达水平均显著增高。结论特异性激动小鼠α7n AChR能够使海马组织中突触相关蛋白水平表达增加。这可能提示了α7n AChR与突触密切相关,这可能与其神经保护作用有关。     

慢性氟中毒大鼠海马区病理学改变

目的：复制饮水型慢性氟中毒大鼠模型,观察模型大鼠大脑海马各区病理学改变及维生素E（VitE）拮抗氟中毒脑损伤的效果.方法：健康纯系SD大鼠36只,随机均分为对照组、染氟组及染氟-VitE拮抗组,雌雄各半,实验期10个月;观察大鼠氟斑牙发生情况,用氟离子选择电极法测定尿氟含量,利用光学显微镜观察各组大鼠脑组织海马病理学改变.结果：染氟组大鼠出现不同程度的氟斑牙,尿氟含量（2.35±0.51）mg/L明显高于对照组（1.50±0.14） mg/L,差异有统计学意义（P＜0.05）;染氟-VitE拮抗组氟斑牙程度及尿氟含量（1.95±0.12） mg/L均低于染氟组,差异有统计学意义（P＜0.05）;光镜下染氟组大鼠脑组织海马CA3、CA4区神经元胞浆及胞核未见明显改变,部分区域可见轻度排列紊乱;尼氏染色显示染氟组大鼠海马CA3、CA4区神经元内尼氏小体灰度值为（14.11±4.72）和（13.80±4.60）较对照组（70.06±7.77）和（73.55±5.94）及染氟-VitE拮抗组（37.56±8.68）和（44.54±8.52）明显减少,染色明显变浅,差异有统计学意义（P＜0.01）;染氟-VitE拮抗组较对照组灰度值也明显减少,差异有统计学意义（P＜0.01）.结论：慢性氟中毒可使大鼠出现氟斑牙,尿氟含量升高;大脑海马神经元发生病理学改变,抗氧化剂VitE在一定程度上可降低慢性氟中毒引起的脑损伤.     

史他汀类药物对抗β- 淀粉样肽神经毒性的非胆固醇依赖性作用机制实验研究

目的：研究史他汀类药物通过其非胆固醇依赖性作用对抗β- 淀粉样蛋白（Aβ）的 过程中β- 淀粉样肽前体蛋白（APP）代谢、尼古丁型乙酰胆碱受体（nAChRs）表达以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路的相互作用关系，探讨史他汀类药物对阿尔茨海默氏病（AD）的可能性干预途径。方法：选择原代培养神经细胞及过表达APP670/671 的SHSY-5Y 细胞，用史他汀类药物（包括洛伐他汀、阿托伐他汀、罗苏伐他汀和辛伐他汀）、Aβ、nAChR 拮抗剂或细胞外信号调节白白激酶（ERK）抑制剂分别或合并处理。用生化方法测定细胞存活率、胆固醇含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量；用蛋白印迹法检测nAChR 多种亚单位蛋白表达水平，APP 代谢途径中α分泌型淀粉样前体蛋白（αAPP）、β分泌型淀粉样前体蛋白（βAPP）、β淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACE1）、β淀粉样前体蛋白裂解酶2（BACE2）及解聚素金属蛋白酶结构域蛋白10 （ADAM10）等的蛋白表达水平，MAPK 通路中ERK、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）及p38 磷酸化水平；实时荧光定量PCR 测定nAChR 亚单位mRNA 表达水平。结果：用Aβ或Aβ寡聚体处理体外培养神经细胞48 小时后见细胞存活率下降、SOD 的活性降低和MDA含量增高等毒性作用，用史他汀类药物预处理细胞24 小时，均能减轻Aβ引起的神经毒性作用。用洛伐他汀处理培养细胞24 小时后，发现α7 nAChR 蛋白及mRNA 表达水平均升高，而α4、α3 和bβ2 未见明显改变；洛伐他汀处理引起αAPP 分泌增加、βAPP减少、BACE1 蛋白表达水平降低、而BACE2 和ADAM10 增高。洛伐他汀处理亦导致phospho-ERK1/2 蛋白表达水平升高，而phospho-JNK 和phospho-p38 未见明显改变。联合应用洛伐他汀与MAPK/ERK1/2 抑制剂U0126 或α7 nAChR 拮抗剂MLA 处理培养细胞，结果显示U0126 可以抑制细胞phospho-ERK1/2 的磷酸化，降低α7 nAChR 蛋白表达水平，减少αAPP 的分泌，同时阻断洛伐他汀引起的MAPK/ERK1/2 信号转导通路活化、α7 nAChR 蛋白表达水平升高以及αAPP 分泌增加等作用；MLA 处理神经细胞仅能减少αAPP 的分泌，对其自身的蛋白表达及phospho-ERK1/2 的磷酸化均无明显影响，MLA 与洛伐他汀共同处理细胞后仅见洛伐他汀诱导的αAPP 分泌增加作用被减弱，而MAPK/ERK1/2 的活化以及α7 nAChR 蛋白表达水平的上调均未被减弱。结论：采用不引起细胞胆固醇水平改变的史他汀类药物剂量处理培养细胞，能减轻Aβ引起神经细胞毒性作用，引起MAPK/ERK1/2 信号转导通路活化、α7 nAChR 蛋白表达水平升高以及αAPP 分泌增加；其作用机制可能是首先活化phosphor-ERK1/2 信号转导通路，该通路的活化刺激α7 nAChR 的表达，最终增强APP 的非淀粉样代谢过程，活化α- 分泌酶，从而促进αAPP 的分泌，产生对抗Aβ的神经保护作用。     

沉默信息调节因子1 对抗APP 高表达转基因小鼠脑组织及β- 淀粉样肽寡聚体处理的原代培养神经元中氧化应激水平升高的作用

目的：由于氧化应激水平升高是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的可能性发病机制之一，而沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的功能与抗氧化有关，本文试图了解SIRT1 是否能对抗β- 淀粉样肽前体蛋白（APP）高表达的小鼠大脑或经β- 淀粉样肽寡聚体（AβOs）处理的神经元中氧化应激水平的升高。方法：APP/PS1 双转基因种鼠与野生型（WT）雌鼠合笼繁殖，筛选出APP/PS1 双转基因小鼠，分别饲养至4 月龄或8 月龄时，用白藜芦醇（RSV，SIRT1 激活剂）或苏拉明（SIRT1 抑制剂）通过灌胃方法处理转基因小鼠，每次20 mg·kg-1 体重/ 天，时间2 个月；采用原代海马神经元培养，用0.5 μmol·L-1 AβOs 处理48 小时后分别用20 μmol·L-1RSV 或300 mg·mL-1 苏拉明处理细胞24 小时。采用CCK-8 方法检测细胞存活率，筛选最佳药物处理浓度；用蛋白印记及实时定量PCR 方法分别检测SIRT1 蛋白和mRNA 表达水平；用免疫组织化学方法检测APP 高表达转基因小鼠脑组织内老年斑分布情况；用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测原代海马神经元中活性氧（ROS）水平；用生物化学方法检测小鼠脑组织及细胞中OH-、H2O2、O2.- 水平，丙二醛（MDA）含量，以及超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果：与WT 小鼠或未经处理的原代神经元相比，APP/PS1 小鼠大脑或经AβOs 处理的神经元中SIRT1 的表达显着降低；小鼠脑组织中老年斑数量明显增加；脑组织及培养神经元中氧化应激水平明显升高，抗氧化酶水平明显降低。APP/PS1 小鼠大脑或经AβOs 处理的神经元中这些异常改变可通过RSV 处理后减弱，而用苏拉明处理后则使其增强。结论：SIRT1 可以降低APP 高表达小鼠大脑及经AβOs 处理的神经元中的氧化应激水平，具有神经保护作用。     

胆碱能毒蕈碱受体的功能及其在慢性氟中毒脑损伤中的作用

胆碱能毒蕈碱受体(muscarinicacetylcholine receptors,mAChRs)简称M受体,是中枢神经系统中与学习记忆能力相关的重要受体。目前,慢性氟中毒对中枢神经系统的损害及学习记忆能力的影响已引起人们极大的重视。本文从M受体在学习记忆中的相关作用机制展开讨论,并结合慢性氟中毒脑损伤发病机制,探讨其相关性。     

胆碱能尼古丁受体在阿尔茨海默病发病机制中的作用

目的：阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease,AD）的病因和发病机制十分复杂,至今仍未完全阐明清楚,极大限制了AD 的有效临床防治。胆碱能神经系统与AD 的发病密切相关,胆碱酯酶抑制剂仍然是目前治疗AD 的首选药物之一,尽管这不是AD 的机制性治疗药物。记忆力衰退及认知功能障碍是AD 的主要临床表现特征,而胆碱能神经型尼古丁受体与大脑学习记忆、认识能力等脑功能有关,还调节多种其他受体的功能、有明显的对抗神经毒性作用。因此,研究该受体与AD 的关系是本课题组长期的AD 研究方向。方法：本课题研究中,选用AD 患者尸体解剖后脑组织、AD 患者血液标本、类AD 转基因或β- 淀粉样蛋白(β-amytoid protein,Aβ) 脑室注射实验动物以及细胞模型等进行了研究,采用 RNA 干扰技术、同位素标记受体- 配体结合实验、相关蛋白及mRNA 的表达测定、细胞膜结构脂质测定、氧化应激指标测定、相关酶活性及细胞因子测定、神经病理学检查等研究方法,从基因水平、受体功能、相关影响等方面研究了神经型尼古丁受体在AD 发病机制中的作用。结果：AD 患者脑组织、类AD 实验动物脑组织及经Aβ 处理的神经型中神经型尼古丁受体表达水平降低及受体结合能力降低,尼古丁受体降低水平与类AD 实验动物学习记忆能力低下密切相关。增强神经型尼古丁受体表达水平可对抗Aβ 的神经毒性作用、降低神经细胞氧化应激及凋亡水平、提升实验动物的学习记忆能力、与细胞膜脂质结构改变及相关信号转导通路异常有密切的相互影响关系。围绕胆碱能受体改变机制对类AD 实验动物和细胞模型采用相应的药物（如中药复方、中药提取物或胆固醇合成抑制剂史他汀类等）处理,所引起的神经细胞尼古丁受体上调作用对AD 发病中的Aβ 前体蛋白代谢途径有明显的影响,可减少Aβ 的产生及减弱其毒性作用,改善类AD 实验动物的学习记忆能力。结论：神经型尼古丁受体表达降低参与了AD 的发病机制,提升尼古丁受体表达水平在改善类AD 动物学习记忆能力方面有明显的干预治疗作用,对Aβ 造成的神经细胞毒性有显著的缓解作用。