布鲁氏菌OMP25与OMP31蛋白的表达及其间接ELISA诊断试剂盒研制

目的 为建立布鲁氏杆菌间接ELISA检测方法。方法 本研究根据GenBank中已登录猪种布鲁氏菌S2株全基因组序列,分别针对omp25和omp31设计一对引物,分别扩增并回收573 bp与783 bp目的基因片段,将其分别克隆入pET-28a原核表达载体中,构建重组质粒pET-OMP25与pET-OMP31,进行酶切鉴定与基因序列测定后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达,OMP25与OMP31蛋白主要以包涵体形式存在;将目的蛋白纯化,应用Western blot进行蛋白活性的检测。结果 纯化的目的蛋白具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为包被抗原,在确定了OMP25与OMP31蛋白最佳配比为4:1、抗原最佳包被浓度为10 μg/mL、血清的最佳稀释倍数为1:50倍稀释、临界值为0.314的基础上,建立羊布鲁氏菌病抗体间接ELISA诊断方法并组装成诊断试剂盒,并将试剂盒进行了特异性、敏感性、重复性、符合率试验、血清交叉反应性等检测。结论 研制的羊布鲁氏菌病抗体ELISA诊断试剂盒具有良好的特异性、敏感性,可重复性,可应用于临床样本检测。     

布鲁氏菌引起的巨噬细胞依赖性树突状细胞迁移与免疫应答

目的: 研究阴道巨噬细胞清除后小鼠对布鲁氏菌疫苗的免疫应答机制.方法: BALB/c小鼠60只随机分为3组, 每组20只, 实验组小鼠阴道内滴注脂质体包裹的clodronate以清除阴道巨噬细胞, 3 d后阴道滴注10 μL布鲁氏菌疫苗(含6×108个布鲁氏菌).同时设空脂质体对照组(不含clodronate)和PBS对照组.依次在12、 24、 36、 72 h收集小鼠阴道、髂内淋巴结和血液.采用免疫组织化学染色法观察阴道巨噬细胞清除效果和树突状细胞(DC)的迁移, 并用ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-4的含量.收集小鼠腹腔液制备巨噬细胞进行细胞培养, 1.2×106个巨噬细胞中加入布鲁氏菌疫苗10 μL, 于不同时间点对巨噬细胞进行姬姆萨染色, 观察巨噬细胞的变化.结果: 清除巨噬细胞组小鼠接种布鲁氏菌疫苗后, 髂内淋巴结中S-100阳性DC数量没有明显的变化, IFN-γ和IL-4的含量也没有明显的升高.非清除组中, 不同的时间点, 髂内淋巴结中S-100阳性DC明显增多, 与PBS对照组相比, IFN-γ含量显著增高, 而IL-4则没有明显变化.体外巨噬细胞负载布鲁氏菌疫苗发现, 随着时间的延长, 巨噬细胞吞噬布鲁氏菌逐渐增多, 在12 h, 巨噬细胞开始出现坏死性凋亡.结论: 小鼠在对布鲁氏菌疫苗的免疫应答中, DC的迁移是巨噬细胞依赖性的, 并且这种依赖性有可能是由布鲁氏菌抗原成分在细胞间间接传递引起的.     

迁移性树突状细胞与淋巴结内树突状细胞在抗B.suis免疫应答中的作用

目的:研究迁移性树突状细胞与淋巴结内树突状细胞在抗猪布鲁氏菌免疫应答中的作用。方法:48只BALB/c小鼠随机分为3组:Ⅰ组为正常对照组,阴道滴注PBS;Ⅱ组为巨噬细胞(Mφ)清除组,每只小鼠阴道滴入清除剂;Ⅲ组为未清除Mφ组,每只小鼠阴道滴注同体积的liposome-PBS;48小时后Ⅱ组、Ⅲ组均阴道接种猪布鲁氏菌,对照组阴道滴注PBS。各组小鼠分别在接种12、24、48和72小时采集血液和髂内淋巴结,采用免疫组织化学染色法观察淋巴结内树突状细胞(DC)的分布,用ELISA法检测血清中IFN-γ和IL-4的含量。结果:未清除Mφ组小鼠接种布鲁氏菌后髂内淋巴结内有大量DC迁移,至12小时血清IFN-γ水平显著增高,与对照组相比差异显著(P0.05),48小时达到高峰,显著高于对照组(P0.01)。清除Mφ组小鼠接种布鲁氏菌后,髂内淋巴结内没有明显的DC迁移,各时间点血清IFN-γ水平明显高于PBS对照组(P0.05),但明显低于未清除Mφ组(P0.05)。各组IL-4水平的差异无统计学意义(P0.05)。结论:迁移性DC和淋巴结内DC在启动抗布鲁氏菌细胞免疫应答中均发挥重要作用,并具有协同作用的特点。     

布鲁氏菌的致病机制与细胞免疫机制研究进展

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(brucella species, Bru)感染引起的一种严重人兽共患传染病,人在接触患病动物或被污染的动物产品后即可发病,世界上每年布鲁氏菌病发病人数超过 50万[1]。Bru 是一种兼性细胞内感染细菌,菌体表面最主要的抗原是脂多糖（LPS）和外膜蛋白等,其感染的靶细胞主要是巨噬细胞与胎盘滋养层细胞,但也可在树突状细胞（dendritic cell, DCs）中生长繁殖。该菌不仅具有抵抗吞噬细胞杀菌作用的能力,并可阻止抗原特异性T 细胞对其识别,从而形成有利于其生存和繁殖的微环境,导致慢性持续感染[2 ,3 ] 。该病主要以 Th1 型细胞免疫应答为主,由 DCs 诱导的细胞免疫应答在机体抗 Bru 感染中发挥着重要作用。本文在分析 Bru 主要抗原分子生物学特性的基础上,就 Bru 的致病机制及巨噬细胞与 DCs 参与的机体抗 Bru 过程的研究进展作一综述。     

巨噬细胞在树突状细胞启动抗布鲁氏菌免疫应答中的作用

目的研究巨噬细胞(MΦ)在树突状细胞(DCs)启动抗布鲁氏菌免疫应答中的作用。方法用免疫组织化学染色法观察引流淋巴结内DCs的分布变化,用ELISA法检测阴道黏膜MΦ清除组和未清除组小鼠阴道接种布鲁氏菌疫苗后血清中IFN-γ、IL-4的含量,将MΦ与DCs体外负载布鲁氏菌疫苗,比较二者形态学变化。结果清除组接种疫苗12h～72h后,只见到少量的DCs散布于小鼠髂内淋巴结的皮质区和副皮质区;而未清除组阴道接种疫苗12h后,髂内淋巴结皮质区内DCs数量急剧增加,细胞密度增大并逐渐由皮质区向副皮质区迁移。清除组小鼠血清IFN-γ含量比未清除组有所下降,但显著高于PBS对照组(P<0.05);而各组小鼠血清IL-4含量保持基本一致。MΦ体外负载布鲁氏菌12h后胞质脱落,细胞核固缩,并释放出膜包小泡,而DCs却始终保持形态结构的完整。结论DCs启动抗布鲁氏菌Th1型免疫应答是一个MΦ依赖过程,MΦ吞噬布鲁氏菌后出现坏死性凋亡变化可能是这种依赖过程的机制。