浙江省2002－2018年病毒性脑膜炎病原学与分子流行病学特征

目的 了解2002-2018年浙江省病毒性脑膜炎病原学及分子流行病学特征。方法 从设立的监测点医院采集疑似病毒性脑膜炎患者样本2 173份,其中脑脊液1 718份、粪便455份,用荧光定量PCR方法检测脑脊液中人类肠道病毒(HEV)、腮腺炎病毒(MuV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)和乙型脑炎病毒(JEV)核酸,粪便样本只检测HEV;用ELISA方法检测脑脊液中上述5种病毒IgM抗体;对HEV核酸阳性样本扩增病毒VP1基因和测序,确定病毒型别并进行进化分析。结果 在2002-2018年2 173份样本中检出HEV核酸阳性871份(40.1%),其中脑脊液1 718份、阳性654份(38.1%),粪便455份、阳性217份(47.7%);871份HEV核酸阳性样本,VP1扩增测序阳性670份,其中HEV-A 5份、HEV-B 665份,涉及23个病毒血清型,分别为柯萨奇病毒(CV)A组CVA4、CVA6、CVA9、CVA10,CVB组1~5, 埃可病毒(EchoV;E)E3、E4、E6、E7、E9、E11、E14、E16、E18、E21、E25、E30、E33和肠道病毒(EV)-71,位于前3位的分别为E30、E6和CVB5,该3个血清型间隔若干年呈现病毒活动性增强的趋势。从2012-2015和2018年795份脑脊液中检出HEV核酸阳性374份、MuV 6份、HSV和CMV均为5份,对其中的368份脑脊液同时检测5种病毒IgM抗体,HEV抗体阳性2份、JEV 6份、MuV 1份。670份HEV中除1份EV-71外,EchoV 517份、CV 152份,两者之比为3.4:1,两类病毒间隔3~5年存在优势株交替变化的趋势。VP1进化树显示,浙江省HEV位于HEV-A和HEV-B分支上,E30存在h和i基因亚型。结论 浙江省病毒性脑膜炎的主要病原为HEV-B;EchoV检出率明显高于CV,两类病毒存在交替变化的趋势;优势血清型E30、CVB5和E6间隔若干年呈现病毒活动性增强的趋势;监测点HEV活动强度与病毒性脑膜炎暴发疫情的发生两者之间在时间上有较好的相关性。     

浙江省乙型流感病毒HA1基因分析

目的：了解浙江省近几年乙型流感病毒的基因变异情况和WHO推荐流感疫苗株对浙江省人体的保护情况。方法：采集浙江省类流感样本进行流感病毒的分离和鉴定，并对分离到的乙型流感病毒进行核酸的提取，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增病毒基因后进行病毒血凝素HA1基因核苷酸序列测定，用DNAMAN和BioEdit生物软件对测序结果进行分析处理，并与WHO推荐疫苗株基因进行比对。结果：分离到Yamagata系和Victoria系两个进化系的乙型流感病毒，两系毒株均未发现核苷酸的丢失和插入，糖基化位点没有太大改变。毒株之间核苷酸的同源性为95.25%，氨基酸的同源性为95.28%。Yamagata系毒株HA1区域核苷酸序列长度为1038 bp，推导的氨基酸序列长度为346个，氨基酸变异替换数在6-8之间；Victoria系毒株HA1区域的核苷酸序列长度为1041 bp，推导的氨基酸序列长度为347个，氨基酸变异替换数在2-8之间，相比Yamagata系毒株在163位上都多1个天冬酰胺（N）。基因进化树上可见明显的Yamagata系和Victoria系两个分支。结论：浙江省人群交替流行着Yamagata系和Victoria系两个抗原性不同的进化系的乙型流感病毒，病毒的基因发生了变异，抗原已发生漂移。2001、2006两年WHO推荐乙型流感疫苗株与我省当年流行株为不同谱系毒株，预防保护效果不够理想，其余年份为同一谱系毒株，预防保护效果较好。     

浙江省近几年甲3亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因分析

目的通过浙江省1998~2005年甲3亚型流行性感冒(流感)病毒的神经氨酸酶(NA)基因的序列比较,阐明近几年NA基因的变异与流感流行的关系。方法对浙江省1998~2005年流感流行期间分离的甲3亚型流感代表性毒株,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒NA基因,进行核苷酸序列测定,并用Bio-Edit软件作分析处理。结果浙江省近几年流感流行期间分离到甲3亚型流感病毒代表株13株,其NA基因核苷酸长度均为1 338bp,由此推导的氨基酸数为446个。1998~2005年甲3亚型流感病毒在NA基因区发生可遗传的氨基酸变异达22个,其中1998~1999年、1999~2002年变异最大,均达到9个氨基酸的差异;2003年后病毒的变异趋向平稳,这与NA基因系统进化树的结果相一致。此外,近几年来世界卫生组织推荐的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间存在一定的差异,而在2003年后的甲3亚型流感疫苗株与当年的流感流行株之间的符合程度较好。结论近年来浙江省甲3亚型流感病毒的NA区域与血凝素区域相似,均发生了较大的抗原性漂移,提示1999~2005年发生的2次流感流行是由于当年的甲3亚型流感分离株变异影响到病毒的抗原性所导致的。     

门诊小儿输液管理的难点及对策

静脉输液是临床上一种最常用的给药方法。由于小儿具有自身的生理、心理特性 ,因而 ,在对小儿的输液管理中 ,除了要做好一般的输液护理外 ,还要根据其特性做好特殊护理。也就是说 ,小儿的输液比成人难于管理。1　难点分析1.1　输液过程“三难”静脉穿刺难、针头固定难、拔针按压难。我们对 1999年1月第二周中门诊输液的 5 4 0例小儿进行统计 ,静脉输液一次成功者 32 8例 ,占 6 0 .74 % ,静脉穿刺二次成功者 110例 ,占 2 0 .37% ,静脉穿刺二次以上成功者 10 2例 ,占 18.89%。重复穿刺因护士技术不过关者 97例 ,占 4 5 .75 % ;小儿大幅度动作…     

急性咽结膜热的分子病原学诊断

2004年夏季，浙江省某地发生了一起急性咽结膜热疫情，有62例发病，其中男38例，女24例，53例在发病前均有明确的游泳史。为明确病原学诊断，我们对部分急性期患者的咽拭子和眼拭子标本开展了荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测和病毒分离，同时利用基因测序、BLAST比对和构建腺病毒hexon基因进化树确定了病毒型别特征。     

半巢式RT-PCR法检测呼吸道合胞病毒

目的建立快速、敏感、特异的人呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus，RSV)检测方法。方法根据RSVF基因的保守序列设计3条引物，建立半巢式RT-PCR(semi-nested RT-PCR)检测方法。用该方法检测125例患急性下呼吸道感染的婴幼儿的鼻咽吸引物(nasopharyngeal aspirates，NPA)标本，同时对标本进行病毒分离和直接免疫荧光法检测。结果该半巢式RT-PCR灵敏度为0．1TCID50，用该方法在125例标本中共检出RSV阳性标本63例，阳性率50．4％。结论建立快速、敏感、特异的RSV半巢式RT-PCR检测方法，该方法适用于临床早期诊断和流行病学监测。     

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒

目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT—PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸，并初步应用于登革热的临床标本检测。方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列。应用生物学软件进行序列比对，分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT—PCR反应条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性，与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应，检测的灵敏度均达0．1TCID50，可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT—PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法，适用于临床早期诊断。     

一起疑似病毒性脑膜炎暴发病原学检测分析

目的 2014年10月浙江省金华市荣光小学发生疑似病毒性脑膜炎暴发疫情,为及时查明病因,分析病原的分子特征并进行病原溯源。方法 开展流行病学调查,采集患者脑脊液和咽拭子样本6份,检测人类肠道病毒（HEV）核酸和分离病毒,对HEV分离株VP1基因测序,进行同源性与进化分析。结果 在全校328名学生中,发病7例,罹患率2.13%。患者年龄7~8岁;临床症状为发热、头痛、呕吐等;从5例患者6份样本中均检测到HEV核酸,其中3份脑脊液中分离到3株肠道病毒埃可30型（echovirus 30,E30）;新分离株与E30原型株之间VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为81.8%和91.8%~92.1%;进化分析显示：新分离株位于E30 G基因亚型分支上,与2013年浙江省CHN/ZJ/RA-72/13株亲缘关系最近。结论 引起2014年10月浙江省金华市荣光小学聚集性病毒性脑膜炎暴发疫情的病原为E30 G基因亚型病毒。     

新型人感染H7N9禽流感病毒病原学研究进展

2013年中国暴发的新型人感染H7N9禽流感引起了全世界的关注。本文通过整理目前已发表在数据库（PubMed）上的新型人感染H7N9禽流感病原学方面文章,对关于该病毒核酸检验、序列分析、溯源研究,以及其致病力、耐药性和传播力研究等方面已经明确的结论进行综述。该病毒核酸可以通过各种数量实时定量PCR方法检测,有较好的敏感度和特异性,能较快获得检测结果,其中逆转录实时荧光定量PCR仍是目前检测的主流方法。该病毒来自于禽类,对禽类属于低致病性病毒,但经过近几年的多次重组事件后,已能和人呼吸道受体α-2,6Gal结合,并可通过直接接触传播感染人类引起较为严重的临床过程。除H7N9之外,其他新重组形成H7亚型,如H7N7,亦具有较高的哺乳动物感染力,因此需加强对禽流感病原监测。相比容易感染青少年的高致病性人禽流感H5N1病毒,新型H7N9病毒更易引起老年人的严重呼吸系统症状。虽然已经出现耐神经氨酸抑制剂毒株,但是该病毒临床仍可用奥司他韦等药物进行治疗,目前已发现其他药物可以抑制耐药与非耐药毒株在体内的复制。如出现聚集性病例,其感染来源可能存在共同暴露史,但亦不能排除存在有限的、非持续的人传人可能。     

B型呼吸道合胞病毒荧光定量RT-PCR检测

目的建立B型人呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）的快速荧光定量RT-PCR检测方法。用于B型RSV实验室早期诊断与病毒核酸的定量分析。方法利用B型RSVN基因保守区设计引物和TaqMan-MGB（minor groove binder，DNA小沟结合物）探针，优化反应体系和反应条件；并对方法进行特异性、灵敏度和重复性评价；同时以10倍梯度稀释的质粒为标准品建立荧光定量RT-PCR的标准曲线，构建定量分析模型。并用该方法对100份临床呼吸道样本进行检测。结果该方法与其他呼吸道病毒均无交叉反应，检测灵敏度达1TCID50／ml 50％组织培养物感染剂量病毒滴度，临床样本中B型RSV的检测阳性率达18％。结论B型RSV荧光定量RT-PCR检测方法快速、敏感、特异，适用于B型RSV的早期诊断和核酸定量分析。