应用低压逆相脂质体包裹技术提高小分子Mart-127-35的免疫原性

为提高恶性黑色素瘤抗原Ｍａｒｔ ｌ2 7-3 5肽的免疫原性 ,有效地在体诱发保护性免疫应答 ,本研究采用负压逆相蒸发技术 (ＲＥＶ) ,制备脂质体 ,包裹Ｍａｒｔ 12 7 3 5肽 ,免疫小鼠 ,并与常规应用完全弗氏佐剂 (ＣＦＡ)相比较 ,观察 2种方法对提高该小肽免疫原性的影响。1　材料与方法1.1　脂质体包裹Ｍａｒｔ 1肽的制备与鉴定　根据参考文献 [1]的方法 ,略做改动。所得产物对ＰＢＳ(4℃ )透析过夜 ,去除游离肽和痕量有机溶剂。终产物用 0 .4 μｍ滤膜过滤。取部分用磷钨酸负染 ,在透射电镜下放大 4～ 5万倍观察形态 ,余分装保存于 - 70℃冰…     

HBV颗粒的纯化及生物学活性鉴定

目的优化纯化HBV患者血清中HBV颗粒的技术方法。方法在蔗糖介质中,分别以100 000 g和70 000 g进行不连续蔗糖梯度(60%,45%,35%,25%,15%)离心5 h,离心后,分段吸取6份收集液,PCR荧光定量检测各组分HBV滴度;收集前5份收集液进行超滤,去蔗糖,PCR荧光定量检测HBV超滤液;电镜观察70 000g纯化后的HBV超微形态;70000 g纯化后的HBV颗粒感染树鼩肝细胞,检验70 000 g纯化后的HBV感染活性。结果100 000 g离心造成大量HBV在离心过程中损失,收获率只有21%,70 000g离心不仅降低了离心中的病毒损失,而且可有效对HBV和血清进行分离,收获率达到78%以上,较100 000g还提高3.7倍多。电镜可观察到纯化后病毒液中有大量的病毒颗粒;纯化后的HBV颗粒感染活性良好,可有效感染原代树鼩肝细胞。结论70 000 g不连续蔗糖梯度离心可有效分离纯化HBV病毒,较100 000 g收获率明显提高,纯化后的HBV不但具有典型的HBV特征,还具有良好的生物学感染活性。     

HBV转基因小鼠肝脏NKT细胞功能与PD1、CD28表达分析

目的研究HBV转基因小鼠肝脏中NKT细胞的功能与表面PD1、CD28表达的关系。方法分离小鼠肝脏、脾脏、胸腺和腹膜淋巴结单个核细胞,利用流式细胞检测技术,分别检测其淋巴细胞中NKT细胞的频率,同时检测肝脏NKT细胞PD1、CD28的表达及IFN-γ、IL-4的分泌功能,比较肝脏、脾脏、胸腺和腹膜淋巴结这几个主要免疫组织淋巴细胞中NKT细胞所占的比例,并分析肝脏NKT细胞PD1、CD28的表达与细胞功能的关系。结果与正常同品系小鼠比较,HBV转基因小鼠肝脏、脾脏、胸腺和腹膜淋巴结NKT细胞数量明显减少(P<0.05),与脾脏、胸腺和腹膜淋巴结相比,肝脏淋巴细胞中含有大量的NKT细胞;与正常同品系小鼠比较,HBV转基因小鼠肝脏NKT细胞PD1的表达明显增多(P<0.05),CD28的表达明显减少(P<0.05),肝脏NKT细胞IFN-γ、IL-4的分泌功能明显降低(P<0.05)。结论肝脏中含有大量的NKT细胞,HBV转基因小鼠肝脏NKT细胞的功能存在明显的缺陷,并提示PD1的增加和CD28的降低可能与NKT细胞功能的下调密切相关。     

IL-10、TNF-α对慢性乙型肝炎患者树突状细胞的影响

目的 研究IL-10和TNF-α对慢性乙型肝炎患者树突状细胞的分化与功能的影响.方法 健康志愿者和慢性乙型肝炎患者各15例,取外周静脉血,分离获得外周血单个核细胞(PBMC),常规培养获得DC组.培养期间用IL-10刺激的为imDC组;TNF-α刺激的为mDC组;先后用IL-10、TNF-α刺激的为imDC+TNF-α组.各组收获细胞后分别检测反映DC成熟度的各种分子及其体外诱导的自体淋巴细胞增殖效应.结果 源于慢性乙型肝炎患者的常规培养的Dc在数量,HLA-DR、HLA-A、B、C和CD86表达,IL-12p70分泌及其诱导的淋巴细胞增殖效应,均低于健康者组(P＜0.01).源于慢性乙型肝炎患者的mDC与健康者mDC表达的HLA-DR、HLA-A、B、C和CD86比较无显著性差异;2组mDC诱导自体淋巴细胞增殖效应和分泌的IL12p70均明显增加,比较有显著性差异(P＜0.01);2组imDC的HLA-DR、HLA-A、B、C和CD86低表达,分泌的IL-12p70极低,不能强烈激活诱导淋巴细胞增殖效应,与DC组比较有显著性差异(P＜0.01).加入TNF-α刺激后HLA-A、B、C,HLA-DR,CD86仍低表达,分泌的IL-12pT0和淋巴细胞增殖效应仍较低.健康对照组、慢性乙型肝炎组的上清夜中IL-21的ELISA检测值均较低,无显著性差异.结论慢性乙型肝炎患者常规培养的DC在数量和功能上低于健康者.TNF-α可促进常规培养的DC成熟为mDC、IL-10可抑制DC成熟.慢性乙型肝炎患者的DC同健康者一样可进行有效的调控,分化成熟后功能强于健康者常规培养的DC,或可提高自体DC治疗性疫苗在不同免疫状态下的治疗效果.     

多表位组合肽诱导HLA-A2+人PBMC产生抗原特异性CD8+ T细胞应答的研究

目的 探讨基于HBV抗原优势表位的治疗性多肽抗原组分、结构与体外诱导CD8^ T细胞应答之间的关系。方法 用计算机辅助分子设计技术，设计基于HBV抗原免疫优势性CTL表位、B细胞表位和破伤风类毒素通用Th细胞表位的3种治疗性多肽候选疫苗分子，经Merrifield固相多肽合成技术合成，并经HPLC纯化、鉴定。以HLA-A2^ 健康人和慢性乙型肝炎患者的PBMC为实验对象，进行体外诱导CD8^ T细胞应答的免疫学功能研究。结果所设计治疗性多肽分子可在体外诱导较强的抗原特异性CD8^ CTL应答；“-AAA-”铰链区设计和“Th B”细胞表位的引入可增强CTL表位肽的免疫原性。结论 提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中，短而高柔性的“铰链区”设计和“Th B”细胞表位的引入可显著提高小分子表位肽的免疫原性。     

基于HBV核心抗原CTL表位的治疗性多肽在体诱导抗原特异性细胞免疫应答的研究

目的：探讨基于表位的治疗性多肽抗原组分、结构与诱导免疫应答之间的关系。方法：用分子设计的理论和方法，设计基于HBV抗原免疫优势性CTL、Th及B细胞表位的3种治疗性多肽候选疫苗分子，经Merrifield固相多肽合成技术合成，并经HPLC纯化、鉴定。以BALB/c(H-2^d)纯系小鼠为实验对象，进行体内免疫学功能研究。结果：所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CTL应答和适度的抗体反应。Th、B细胞表位的引入可增强CTL表位肽的效应。结论：提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中，引入B-、Th表位可显著提高CTL表位肽的免疫原性。     

正常及肿瘤细胞中参与IL─3基因表达调节的转录因子研究

应用凝胶迁移率分析法，以静止与激活的正常人原代Ｔ淋巴细胞和Ｊｕｒｋａｔ细胞为材料，以ＩＬ－３基因５′侧翼含κＢ样位点的序列为探针，考证ＮＦ－κＢ是否参与ＩＬ－３基因表达的调节。结果表明：①在以ＰＨＡ／ＰＭＡ刺激及未刺激的Ｊｕｒｋａｔ细胞和正常人Ｔ淋巴细胞中，都存在与这一序列结合的蛋白带，其中在刺激后的正常人Ｔ淋巴细胞中出现了一条新的蛋白结合带，而Ｊｕｒｋａｔ细胞中则没有新带型出现，但刺激后的结合带强度显著高于未刺激组。②正常人Ｔ淋巴细胞和Ｊｕｒｋａｔ细胞中，与此序列结合的蛋白带型是不相同的。③当用１５０倍克分子过量的未标记探针与３２Ｐ标记的探针竞争结合核蛋白因子后，从凝胶迁移中清楚地看到Ｊｕｒｋａｔ细胞和正常人Ｔ淋巴细胞中的蛋白带都特异地消失。以上结果提示：①ＩＬ－３基因５′侧翼的κＢ样序列的确存在与之特异结合的蛋白因子，且该蛋白因子的表达是可诱导的。②正常细胞和肿瘤细胞中，与κＢ样序列结合的转录因子是不完全相同的。从而提示：在正常细胞和肿瘤细胞中，ＩＬ－３基因表达调控的机制可能并不完全一致     

脂类分子内佐剂Th/CTL多表位肽体内诱导HLA-A2转基因鼠HBV特异性CTL应答的研究

目的 探索如何在体内启动对外源性合成肽抗原的HLA Ⅰ类分子限制性CD8 T细胞应答.方法 应用分子设计方法设计、合成基于免疫优势性HBcAg CTL表位、PreS2 B细胞表位和破伤风类毒素通用T表位的多肽,并在氨基端导入脂类分子内佐剂,分别与以完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)乳化的多肽抗原相比较,在HLA-A2转基因小鼠体内对其诱导T细胞Th1型极化、CD8 CTL扩增及CD8 CTL介导的HBV特异性细胞毒活性的功能进行研究.结果 含脂质分子内佐剂的Th/CTL多表位肽可在HLA-A2转基因小鼠体内诱导强而有效的Th1型极化和CD8 CTL扩增及HBV特异性CD8 CTL介导的细胞毒活性,其免疫原性显著高于CFA和IFA乳化的多肽(P＜0.05);而后二者其免疫原性未见显著差异.结论 Th/CTL多表位肽设计并引入脂质分子内佐剂是在体内有效诱导抗原特异性CTL应答并降低抗原制剂毒副作用的有效途径.     

关于自费硕士研究生培养的现状分析

针对近几年我国自费研究生中存在的问题,分析现有资助形式存在的一些不足,并提出相应的解决思路,加大国家财政投入,强化对高校收费行为的监督,加强对贫困生的资助,拓展新的筹资渠道,不断完善我国的教育事业.