恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端基因导入烟草叶绿体的研究

目的 将恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 C末端msp1-42基因（3D7株）导入烟草叶绿体基因组中并进行同质化筛选,为利用叶绿体表达系统生产MSP1-42蛋白提供基础材料。 方法　 利用烟草偏爱密码子设计克隆恶性疟原虫（3D7株）msp1-42基因的引物,从含msp1-42基因的pBluntmsp质粒中扩增出msp1-42,构建烟草叶绿体表达载体LRrrmsp。通过基因枪转化法转化烟草叶片,在500 mg/L壮观霉素的选择压力下筛选抗性植株,采用PCR鉴定抗性植株的msp1-42基因及aadA基因,对鉴定阳性植株进行同质化筛选（叶片切碎、在含500 mg/L壮观霉素分化培养基上分化出新的植株）3轮以上,并采用多重PCR分析其同质化情况。 结果　 构建了恶性疟原虫msp1-42基因的叶绿体表达载体LRrrmsp。基因枪转化后获得6个转化子,转化频率为0.6个/枪。转化3～5 d后,小块叶片开始增大增厚,并逐渐由绿色变为黄绿色,7～10 d后黄化或白化,再经约30 d的筛选培养,叶片上出现绿色小芽。PCR检测抗性植株的msp1-42及aadA基因,分别扩增出约900 bp与500 bp的条带,与预期相符。多重PCR分析从经过3轮同质化筛选植株的叶绿体基因中扩增出与未转基因烟草对照大小一致的弱条带,表明经过3轮同质化筛选的转基因植株仍含有未插入外源基因的叶绿体基因组。 结论 获得含恶性疟原虫msp1-42的烟草叶绿体表达载体,并将恶性疟原虫msp1-42基因导入烟草叶绿体基因组中,获得尚未完全同质化的转基因烟草。