伯氏考克斯体新桥株感染BALB/c小鼠的实验研究

目的:分析伯氏考克斯体新桥株对BALB/c小鼠的感染性.方法:用伯氏考克斯体新桥株腹腔接种感染小鼠,于感染后7,14,21,28 d分别处死小鼠,采用伯氏考克斯体特异的荧光定量PCR检测感染小鼠肝、脾、肺组织样本中伯氏考克斯体含量.采用间接免疫荧光法检测感染小鼠血清特异性抗体水平.结果:感染后28 d内,小鼠肝、脾、肺组织中均检出大量伯氏考克斯体,第7天检出量最高,脾的含量显著高于肝和肺,肝的含量显著高于肺.随着感染时间延长,伯氏考克斯体检出量呈下降趋势,但血清特异性抗体水平则不断升高.结论:伯氏考克斯体新桥株为强毒株,可以引起BALB/c小鼠较长时间的稳定感染;BALB/c小鼠可以用作伯氏考克斯体感染模型.     

普氏立克次体重组表面蛋白制备和免疫印迹抗原特异性分析

目的克隆与表达普氏立克次体（Rickettesia prowazekii）主要蛋白抗原基因,分析所表达重组蛋白的抗原特异性。方法采用PCR法从普氏立克次体全基因组中扩增其主要抗原基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒;将基因重组表达质粒转化大肠杆菌,用IPTG诱导转化菌表达重组蛋白。将普氏立克次体、莫氏立克次体、立氏立克次体、恙虫病东方体、黑龙江立克次体、贝氏柯克斯体等实验感染小鼠血清与重组蛋白做免疫印迹。结果经过PCR扩增后获得9个目的基因片段,用其构建出9个原核表达质粒;9个原核表达质粒转化菌均高效表达出相应的重组蛋白;结果显示FtsZ、GroEI。Rp828、EF—Ts等4个蛋白特异性最好,仅与普氏立克次体感染小鼠血清反应;其次是Omp,它除与普氏立克次体感染小鼠血清反应外,仅与莫氏立克次体感染血清反应。结论FtsZ等4个重组蛋白为普氏立克次体的特异性抗原,可以作为研制流行性斑疹伤寒血清学诊断试剂的候选抗原。     

黑龙江立克次体外膜蛋白B基因表达及表达重组蛋白的抗原性分析

黑龙江立克次体为远东蜱传斑点热病原体,本文以黑龙江立克次体基因组为模板,扩增ompB的4段基因,利用原核表达载体构建重组表达质粒,IPTG诱导重组质粒转化的大肠杆菌表达重组目的蛋白,并对其抗原性进行分析.免疫印迹反应表明,重组表达的4个蛋白均与黑龙江立克次体感染小鼠血清反应.该4个重组蛋白分别免疫小鼠后,分析其血清的特...     

黑龙江立克次体感染血管内皮细胞的初步研究

目的 通过黑龙江立克次体感染体外培养人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVEC）探讨其在内皮细胞内的生长规律。方法 将泛影葡胺密度梯度超速离心纯化的黑龙江立克次体（HLJ-054株）感染体外培养的HUVEC,通过间接免疫荧光和扫描电镜检测与观察不同时相黑龙江立克次体在内皮细胞内的生长状况。热灭活黑龙江立克次体做平行对照。 结果 立克次体粘附并侵入内皮细胞,在感染后第6h及第24h分别为感染高峰;感染5 d后细胞内立克次体逐渐增殖,第8～9d细胞内立克次体急剧增殖,并见细胞核内有少量立克次体,细胞出现病变,第12d细胞内充满立克次体,大部分细胞皱缩脱落。结论 黑龙江立克次体能够感染血管内皮细胞,在血管内皮细胞内不断增殖而使细胞死亡。     

贝氏柯克斯体重组膜蛋白抗原激活树突状细胞诱导特异性免疫应答

目的分析贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)膜蛋白抗原对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的激活作用,筛选能有效激活DCs的蛋白抗原,探讨该蛋白抗原间接激活T细胞的作用。方法从健康成年人外周血中分离单核细胞,加入GM-CSF和IL-4体外培养单核细胞成未成熟DCs;分别用Cb的5种重组膜蛋白IcmO、EnhA、SecB、Lo1A、HspB刺激DCs;用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测刺激后DCs表面分子表达。结果 SecB刺激的DCs表达CD83,CD86,CD80,CD54,CD58,和CD40水平显著高于其它4种蛋白;将SecB激活DCs或SecB激活DCs培养上清刺激T淋巴细胞,FACS检测显示刺激后CD4+和CD8+细胞高水平表达的T淋巴细胞活化标志CD69以及细胞因子IFN-γ和TNF-α。结论 SecB膜蛋白抗原能有效激活DCs和它所激活DCs能够诱导特异性细胞免疫应答,为贝氏柯克斯体潜在保护性抗原。     

贝氏柯克斯体新桥株刺激人树突状细胞的表型分析

目的树突状细胞(dendritic cell,DC)具有成熟与未成熟两种形态,前者是早期免疫应答强有力的抗原呈递细胞,后者能诱导免疫耐受。分析贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii,Cb)、Cb脂多糖(LPS)、去除LPS的Cb对DC的激活作用,探讨Cb逃逸宿主免疫清除的机理。方法从健康成年人的外周血中分离单核细胞,加入GM-CSF和IL-4体外培养单核细胞成未成熟DC;分别用灭活Cb、Cb LPS、去LPS Cb刺激体外培养未成熟DC,大肠杆菌LPS作为阳性对照刺激因子;刺激后24h,用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorter,FACS)检测DC表面分子:成熟标记分子CD83与共刺激分子CD40、CD58、CD80、CD86。结果去LPS Cb刺激DC表面分子表达水平与大肠杆菌LPS刺激最相近,显著强于未刺激DC,而灭活Cb、Cb LPS刺激DC表面分子CD83、CD40、CD80、CD86的表达在一低水平。结论LPS遮盖了Cb激活DC所需的表面分子,除去LPS后暴露的分子与DC相互作用,对DC的成熟刺激作用显著高于灭活Cb、Cb LPS的刺激作用。LPS的存在有利于贝氏柯克斯体逃逸宿主的免疫清除。     

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分Q热疫苗的免疫原性及免疫保护性研究

目的实验评价氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分(CMR)疫苗的免疫特性及免疫保护性。方法采用国内分离贝氏柯克斯体新桥株制备CMR疫苗,用CMR免疫Balb/c小鼠;采用间接免疫荧光法检测CMR免疫小鼠血清特异性抗体水平和用淋巴细胞增殖试验评价CMR疫苗体外刺激小鼠脾细胞增殖的能力;以贝氏柯克斯体攻击免疫小鼠和用贝氏柯克斯体特异的荧光定量PCR检测感染小鼠血和脾脏样本。结果CMR免疫第4周起,小鼠血清中检出高水平的特异性抗体,CMR加氢氧化铝佐剂免疫小鼠的血清特异性抗体显著高于未加佐剂组。CMR在体外刺激正常小鼠和免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平显著高于对照组,WCV则抑制正常脾淋巴细胞增殖。三种剂量(30μg、10μg、1μg/只)CMR免疫小鼠血和脾脏样本贝氏柯克斯体含量显著低于未免疫组,以30μg组及加佐剂免疫小鼠的样本含菌量更显著低于对照组。结论采用我国分离株制备的CMR疫苗能诱导机体产生高效特异性体液免疫和细胞免疫应答,使机体抵抗大剂量的贝氏柯克斯体感染,具有良好的免疫原性和免疫保护性;氢氧化铝佐剂能显著增强CMR疫苗的免疫保护效能。     

五日热巴通体重组外膜蛋白HbpA的研制和抗原性分析

为克隆并表达五日热巴通体外膜蛋白HbpA的基因,并对其抗原性进行初步分析,采用PCR方法从五日热巴通体基因组DNA扩增hbpA基因,将目的基因片段插入原核表达质粒pET32a（＋）,构建重组质粒pET32a（＋）-hbpA;将构建的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）并诱导目的基因表达,以SDS-PAGE电泳以及免疫印迹实验分析表达的目的蛋白。SDS-PAGE电泳分析发现pET32a（＋）-hbpA转化菌高效表达一48kDa重组蛋白;免疫印迹分析发现该蛋白与其免疫血清发生强烈反应;间接免疫荧光分析发现该重组蛋白免疫血清能特异识别五日热巴通体。实验结果表明五日热巴通体外膜蛋白HbpA的基因已在大肠杆菌中高效表达。     

贝氏考克斯体毒力与毒力相关蛋白芯片的研制

目的:构建贝氏考克斯体毒力与毒力相关蛋白芯片.方法:根据贝氏考克斯体全基因组序列,筛选出约160个编码毒力及毒力相关蛋白的基因,采用PCR扩增基因片段,将获得的基因片段与pET32a表达载体连接,然后将该重组质粒转化大肠杆菌并使目的基因表达,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达的目的重组蛋白.将纯化的重组蛋白点在醛基化玻片上制备蛋白芯片.结果:由贝氏考克斯体104个重组蛋白构建毒力与毒力相关蛋白芯片,通过荧光扫描仪分析蛋白芯片与贝氏考克斯体感染的小鼠血清反应,发现10个重组蛋白与该血清反应为强阳性.结论:所制备的毒力与毒力相关蛋白芯片具有贝氏考克斯体特异性,可用于贝氏考克斯体感染患者血清的检测.     

贝氏柯克斯体感染小鼠血清与其毒力相关蛋白的免疫印迹反应

目的筛选与贝氏柯克斯体感染血清反应的贝氏柯克斯体毒力相关蛋白。方法以贝氏柯克斯体标准株九里株为模板,采用PCR扩增包括IV型分泌系统、分泌性蛋白和膜蛋白在内的毒力及毒力相关的基因,将扩得目的基因片段与原核表达质粒pET32a重组,将重组质粒转化大肠杆菌,用贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清与转化大肠杆菌作免疫印迹。结果设计173对引物共扩增出170个目的基因,经PCR及酶切鉴定,有155个基因与pET32a质粒重组成功,SDS-PAGE电泳分析发现,共有104个转化菌表达目的蛋白,在104个重组蛋白中,筛选到32个与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应的重组蛋白。结论这些与贝氏柯克斯体感染血清反应的毒力相关蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。