Fas配体在髓系白血病细胞中的表达及功能研究

为了解Fas配体 (FasL)在髓系白血病细胞中的表达水平及其诱导Fas+敏感细胞发生凋亡的功能 ,用流式细胞术检测 38例髓系白血病患者 (外周血白细胞 >10 0× 10 9/L)的白血病细胞在新鲜分离及IL 2和IFN γ刺激后表面膜FasL的表达水平 ,将白血病细胞 ( 1× 10 6/ml)与Jurkat细胞 ( 1× 10 5/ml)混合培养 2 4小时后 ,用DNA电泳和流式细胞术双标法检测Jurkat细胞发生凋亡的情况。结果表明 :白血病细胞表面FasL表达量 ( 3.5 9± 1.0 5 ) %高于正常人 ( 0 .36± 0 .16 ) % ,P <0 .0 0 1,经IL 2和IFN γ刺激后其表达量明显增加 ( 7.78± 3.4 0 ) % ,P <0 .0 1;白血病细胞刺激前后诱导Jurkat细胞发生的凋亡率分别为 ( 8.2 8± 1.6 1) % ,( 10 .73± 2 .16 ) % ,差异具有显著性意义。结论 :FasL在髓系白血病细胞表面高表达且对Fas+的敏感细胞具有杀伤功能 ,推测Fas/FasL途径可能在白血病的“免疫逃逸”中发挥作用     

反转录病毒载体介导可溶性Fas的体外表达

将含全长FascDNA的质粒利用PCR技术进行特定片段删除 ,获得sFascDNA。通过DNA重组技术 ,将sFascDNA插入到反转录病毒载体 pLXIN ,构建了重组表达载体pLXIN sFas。经酶切鉴定及测序 ,表明成功地构建了重组表达载体 pLXIN sFas。该载体经PA317细胞包装后 ,感染靶细胞COS 7,分别采用ELISA及凋亡抑制实验检测其蛋白表达量为 (2 .2± 0 .7) μg/ml,且具有良好的生物学活性 ,能明显抑制抗 Fas(CH 11)介导的T淋巴瘤细胞株Jurkat的凋亡。这一结果为探讨Fas和FasL途径在白血病发生中的作用奠定了基础     

Fas系统与肿瘤免疫逃逸

肿瘤通过多种机制逃避免疫系统的监视,Fas与FasL也参与了这一过程.本文将主要阐述Fas与FasL在肿瘤发生中的可能机制.     

Fas抗原与可溶性Fas在急性淋巴细胞白血病中的表达

目的：研究Ｆａｓ和可溶性Ｆａｓ在急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）中的表达,探讨Ｆａｓ在白血病细胞凋亡障碍中的作用。方法：分别用免疫组化ＳＡＢＣ法和双抗夹心ＥＬＩＳＡ法,检测３６例ＡＬＬ患者和１０例正常对照组骨髓Ｆａｓ抗原表达以及血浆可溶性Ｆａｓ（ｓＦａｓ）的水平。用半定量逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）检测１２例ＡＬＬ患者和７例正常对照骨髓细胞Ｆａｓ ｍＲＮＡ的表达。     

Fas系统与肿瘤免疫逃逸

肿瘤通过多种机制逃避免疫系统的监视,Fas与FasL也参与了这一过程。本将主要阐述Fas与FasL在肿瘤发生中的可能机制。     

Fas及其配体与免疫赦免

近年来,发现厂除ＴＮＦ（Ｔｒｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ　ｆａｃｔｏｒ）外目前唯一的介导细胞凋亡的蛋白分子－Ｆａｓ（ｆａｃｔｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｕｉｃｉｄｅ）和ＦａｓＬ（Ｆａｓｌｉｇａｎｄ）,并发现这对膜蛋白分子在免疫调控、免疫病理中有重要作用。值得注意得是近来发现眼、睾丸等免疫赦免区及某些恶性肿瘤细胞高表达ＦａｓＬ,提示Ｆａｓ－ＦａｓＬ参与维持免疫赦免,并且动物实验使异基因胰岛细胞移植物局部表达ＦａｓＬ,成功地诱导了局部免疫赦免,这表明Ｆａｓ系统与免疫赦免有密切关系。这一观点将为临床的器官移…     

国产免疫磁珠分离细胞的方法学研究及初步应用

探讨以国产免疫磁珠进行细胞分离的方法,并评价直接包被法的特异性和敏感性及其在脐血和骨髓Ｃ＾＋３４细胞分离的应用,方法直接包被法、ＳＰＡ法、生物素－亲和素法。结果直接包被法、ＳＰＡ法和生物素－亲合素法均可有效地分离细胞,但以直接包被法最具优势,并证明其有较高特异性和敏感性。     

通过FasL通路阻抑肿瘤免疫逃逸的研究

许多白血病和实体瘤细胞通过高表达Fas配体 (FasL)而发生肿瘤的免疫逃逸。为了观察腺病毒载体向肿瘤细胞导入小鼠可溶性Fas(sFas)基因后能否阻抑肿瘤细胞通过FasL发生肿瘤免疫逃逸作用 ,采用AdEasy腺病毒载体系统 ,利用大肠杆菌内质粒间同源重组的方法分别构建携带小鼠sFas基因及增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的重组腺病毒载体 ,扩增纯化后利用空斑试验测定滴度 ,Westernblot检测蛋白的表达。然后 ,分别感染肿瘤细胞 EL4细胞 ,用氚胸腺嘧啶核苷 ( 3 H thymidine,3 H TdR)掺入法检测其诱导靶细胞YAC 1的凋亡率。结果表明 ,获得了重组成功的复制缺陷的腺病毒载体AdsFas和AdEGFP ,密度梯度离心纯化后其滴度达到 10 11pfu/ml,Westernblot分析证实前者能够高效表达出sFas蛋白。转染肿瘤细胞EL4细胞之后与YAC 1细胞混合培养 ,导入sFas组的YAC 1凋亡率在效靶比 (E∶T)为 3∶1,10∶1和 30∶1时分别为 6 %、7%和 9% ,与对照组 (分别为 2 8%、37%和4 5 % )相比明显下降 ,统计学有显著性差异 (P <0 .0 1) ;而导入EGFP组YAC 1凋亡率 (分别为 30 %、36 %和 4 8% )与对照组相似 ,没有统计学差异 (P >0 .0 5 )。结论 :腺病毒介导sFas的导入能够明显抑制肿瘤细胞EL4诱导Fas+细胞 YAC 1的凋亡 ,说明通过腺病毒转移sFas基因     

人外周血淋巴细胞Fas的表达及细胞凋亡的诱导

目的 研究Ｆａｓ系统对外周血淋巴细胞的影响。方法 将分离、纯化后的淋巴细胞进行单向淋合淋巴细胞培养,用流式细胞术动态检测新鲜分离和激活后的Ｔ淋巴细胞表面Ｆａｓ表达水平,并用ＤＮＡ电泳和原位末端标记技术分别从定性和定量的角度观察Ｆａｓ系统激活与否对混合培养后淋巴细胞凋亡率的影响。结果 Ｔ淋巴细胞在被激活后Ｆａｓ表达水平升高,加抗Ｆａｓ单克隆抗体组的细胞凋亡率高于末加抗体的对照组（Ｐ〈０．０５）。结论     

表达mFasL的新型双顺反子逆转录病毒基因转移体系的建立

为建立表达小鼠 Fas配体 (m Fas L)的内部核糖体进入位点 (IRES)串联的双顺反子新型逆转录病毒基因转移体系 ,用基因重组技术将 m Fas L c DNA基因构建到 IRES双顺反子逆转录病毒载体 (PL XIN)中 ,脂质体法将此重组质粒 PL FIN和空载体 PL XIN分别转染包装细胞 (PA317) ,经 G418筛选出抗性包装细胞克隆 ,基因组 DNA PCR测定基因整合情况。并将抗性 PA317克隆培养上清感染小鼠成纤维细胞系 (NIH3T3) ,筛选出高滴度的 PA317细胞系 ;用流式细胞术测定筛选的 NIH3T3细胞目的基因表达状况 ;以抗性 NIH3T3和 Fas+Yac- 1细胞共培养法检测目的基因的生物学活性。筛选出 12个 PL FIN转染的 PA317细胞克隆中 ,最高产毒效价为 8.5× 10 5CFU(colony- form ing- unit) ;经此上清感染、筛选出的 NIH3T3细胞 ,高表达 m Fas L (阳性率高于对照组 5 2 .5 4% ) ;且能显著诱导 Fas+Yac- 1细胞凋亡 (凋亡率高于对照组 49% )。说明成功建立了表达 m Fas L 的双顺反子逆转录病毒基因转移体系