抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体的筛选、可溶性表达及鉴定

目的 筛选具有较好结合能力的抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体(scFv),并进行可溶性表达和鉴定.方法 前期实验室构建了抗木瓜凝乳蛋白酶全套鼠源scFv噬菌体抗体文库,对抗体文库进行4轮富集后,采用ELISA筛选抗木瓜凝乳蛋白酶阳性scFv;将ELISA最强阳性克隆pFAB5C-scFv的重组噬粒切除gene 3 singal后进行表达,SDS-PAGE分析、双抗体夹心ELISA分析、鉴定表达产物,并将阳性克隆可变区序列与Gene Bank数据库进行同源性比较.结果 经4轮噬菌体展示富集,筛选到3株亲和力相对较高的阳性克隆;去除gene 3 singal后的重组scFv在宿主菌E.coli XL1-blue中主要以可溶性的形式进行了表达,且对木瓜凝乳蛋白酶有较好的亲和力.基因序列分析表明阳性克隆所包含的重链可变区基因(VH)与小鼠免疫球蛋白γ重链基因同源性达96％,轻链可变区基因(VL)和小鼠免疫球蛋白轻链κ基因同源性达98％.结论 成功筛选出结合能力较好的抗木瓜凝乳蛋白酶scFv并进行了可溶性表达,所克隆的scFv基因符合小鼠抗体序列的特征.     

黄连解毒汤对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用

目的 观察黄连解毒汤对在体大鼠急性心肌缺血再灌注损伤(I/R)的保护作用,并探讨其作用机制.方法 采用SD大鼠心肌缺血再灌注模型(I/R),将56只SD大鼠随机等分为7组:假手术组、心肌缺血再灌注组、溶剂(%CMC-Na)对照组、黄连解毒汤(HLJDT)低剂量组、HLJDT中剂量组、HLJDT高剂量组,复方丹参组.连续给药7 d,末次给药24 h后,复制大鼠心肌I/R损伤模型.测定血清肌酸激酶(CK)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、IL-1β水平,测量心肌梗死范围,取心肌组织检测 NF-κB.结果 与假手术组比较,缺血再灌注组血清TNF-α、IL-1β、CK水平明显增高(P<0.05),梗死范围明显增加(P<0.05),且NF-κB表达明显增高(P<0.05);实验组较缺血再灌注对照组的TNF-α、IL-1β、CK、NF-κB水平明显降低,梗死范围明显降低(P<0.05).结论 黄连解毒汤显著缩小心肌梗死面积,降低心肌酶,减少心肌细胞内TNF-α、IL-1β、CK、NF-κB蛋白的表达,发挥对缺血再灌注心肌的保护作用.     

抗木瓜凝乳蛋白酶单链抗体基因的构建、初步筛选和鉴定

目的 :构建抗木瓜凝乳蛋白酶全套单链抗体 (scFv)噬菌体表面展示文库。方法 :从木瓜凝乳蛋白酶免疫小鼠的淋巴细胞中提取总RNA ,反转录成cDNA后 ,用抗体V区简并引物扩增全套VH 和VL 基因。经重叠延伸反应 ,装配成scFv基因 ,并将其克隆到噬粒载体pFAB5C中 ,构建scFv噬菌体抗体库。对抗体库进行亲和筛选后 ,用ELISA法鉴定抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv。结果 :经 4轮“亲和 吸附 洗脱”的富集过程 ,得到ELISA活性较高可与木瓜凝乳蛋白酶结合的克隆。结论 :成功地构建了抗木瓜凝乳蛋白酶的scFv噬菌体展示文库 ,并筛选到与木瓜凝乳蛋白酶具有结合能力的scFv基因     

黄连解毒汤对大鼠心肌缺血再灌注损伤核因子NF-κB信号转导通路的影响

目的观察黄连解毒汤对在体大鼠急性心肌缺血再灌注损伤的保护作用,并探讨其作用机制。方法将56只SD大鼠随机等分为7组:假手术组、缺血再灌注组、溶剂(1%CMC-Na)对照组、复方丹参组及黄连解毒汤(HLJDT)低、中、高剂量组,连续给药7 d,末次给药24 h后,复制大鼠心肌缺血再灌注损伤模型(开胸结扎左冠状动脉前降支30 min,再灌注40 min)。免疫印迹法检查心肌NF-κB的活性,并检测各组大鼠心肌核因子IκB诱导激酶(NIK)、IκB激酶β(IKKβ)、核转录因子抑制蛋白(IκBα)的表达。结果与假手术组比较,缺血再灌注组NF-κB活性显著增加,NIK、IKKβ水平明显增高,IκBα的表达明显降低。与溶剂对照组比较,HLJDT中高剂量组与复方丹参组的NF-κB活性显著降低,NIK、IKKβ水平明显降低,IκBα的表达明显增加。结论黄连解毒汤对大鼠心肌缺血再灌注有保护作用,其作用机制与抑制NIK、IKKβ水平的表达,减少IκBα蛋白的磷酸化降解,从而抑制NF-κB的过度活化有关。     

黄连解毒汤对心肌缺血再灌注心律失常的保护作用

目的:观察黄连解毒汤对在体大鼠心肌缺血/再灌注(I/R)心律失常的影响,并探讨其作用机制。方法:采用SD大鼠心肌I/R模型,将56只SD大鼠随机等分为7组:假手术组、心肌I/R组、溶剂(1%CMC-Na)对照组、黄连解毒汤低剂量组、黄连解毒汤中剂量组、黄连解毒汤高剂量组、复方丹参组,连续给药7d,末次给药24h后,复制大鼠心肌I/R损伤模型(开胸结扎左冠状动脉前降支30min,再灌注40min)。观察再灌注室性心动过速(VT)、室颤(VF)发生率和死亡率;检测左心室心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量。结果:再灌注40min后,实验组较I/R组VT及VF发生率及死亡率均明显降低(P<0.01);实验组I/R组的SOD活力提高(P<0.05),而MDA生成量明显减少(P<0.01)。结论:心肌I/R可导致缺血心肌进一步损伤,黄连解毒汤具有抗大鼠I/R心律失常作用,可能与抑制I/R氧自由基的产生有关。     

黄连解毒汤抑制NF-κB激活减轻心肌缺血再灌注损伤

目的 观察黄连解毒汤(huanglian jiedu decoction,HLJDT)对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用,进一步探讨黄连解毒汤心肌保护作用的机制.方法 采用SD大鼠心肌缺血再灌注模型(I/R),将56只SD大鼠随机等分为7组:假手术组、心肌缺血再灌注组、溶剂(1% CMC-Na)对照组、黄连解毒汤低剂量组、HLJDT中剂量组、HLJDT高剂量组,复方丹参阳性对照组,连续给药7d,末次给药24h后,复制大鼠心肌I/R损伤模型.再灌注40min后测定心肌组织超氧化物歧化酶(SOD)活性及MDA含量和心肌梗死面积,以判定黄连解毒汤对心肌的保护作用;取心肌组织测定NF-κB核转录活性.结果 再灌注40min后,实验组较缺血再灌注对照组心肌SOD活性、丙二醛(MDA)含量和梗死面积有明显改善;实验组较缺血再灌注对照组的NF-κB核转录活性明显减弱.结论 黄连解毒汤对大鼠心肌缺血再灌注有保护作用,其作用机制与抑制NF-κB途径的激活有关.