携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定

目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。     

EV71病毒反向遗传学系统的建立及拯救病毒的鉴定

目的：建立高效的EV71病毒反向遗传学系统,快速获得拯救病毒并鉴定其活性。方法：首先构建含有人RNA聚合酶Ⅰ启动子（Ppol Ⅰ）、ccdB自杀基因和鼠终止子（mTer）的接收质粒pHM-ccdB,并在ccdB两侧引入AarⅠ酶切位点;为了回避EV71病毒基因组中自身的AarⅠ酶切位点,分两段PCR扩增基因组,在引物中引入必需的AarⅠ酶切位点,通过Golden Gate Clone技术连接到目的载体中获得病毒拯救质粒pHT-EV71,转染至RD细胞后,获得拯救的EV71病毒,并以RT-PCR、病毒滴度、Western blot以及电镜检测等方法鉴定拯救子代病毒。结果：通过引入ccdB致死基因和Golden Gate Clone成功构建了EV71病毒的拯救质粒（pHT-EV71）,并将其转染至RD细胞后,观察到明显的致细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,将得到的拯救子代病毒,经EV71 VP1的特异性引物进行RT-PCR扩增,观察到长约1 900 bp的特异性条带;Western blot结果显示,该病毒可与EV71 VP1特异抗体结合;透射电子显微镜（transmission electron microscopy,TEM）检测可见20～30 nm球形病毒颗粒;在RD细胞中将子代病毒连续增殖8代后,检测其毒力高于母本株（6.35 lgTCID50/mL）。结论：通过引入ccdB和Golden Gate Clone技术,建立了快速、高效构建EV71病毒的拯救质粒的方法,效率达到100%,为正链RNA病毒反向遗传学系统的构建提供了一种新的策略,为进一步研究EV71病毒的致病机制及疫苗制备等提供了技术平台。     

3种结核分枝杆菌复活促进因子基因的克隆、原核表达与纯化鉴定

目的构建结核分枝杆菌复活促进因子B(rpfB)、D(rpfD)、E(rpfE)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化。方法采用聚合酶链反应(PCR)以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板扩增出rpfB(1089bp),rpfD(465bp)和rpfE片段(519bp),并连接在pET32a( )载体上,重组质粒用酶切和DNA测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达了rpfB,rpfD和rpfE3种蛋白;利用Western-blot鉴定重组蛋白后,纯化目的蛋白。结果双酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符,测序结果与文献报道一致。经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定均发现分别在61kDa、39kDa、41kDa处有特异性蛋白条带。结论成功构建了3种重组表达质粒pET32a( )-rpfBv、pET32a( )-rpfDv、pET32a( )-rpfEv,并获得了3种高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素研究进展

结核分枝杆菌肝素结合血凝黏附素是一种表面蛋白,有三个功能区,它与人补体成分C3结合可介导单核细胞黏附和吞噬结核杆菌,也与黏附宿主细胞、肺外传播等相关,还可作为有前景的候选疫苗。     

利用CRISPR/Cas9系统检测同源片段长度对重组效率的影响

目的：在大肠埃希菌中利用CRISPR/Cas9系统对插入失活的mCherry红色荧光报告基因进行靶向切割并重组,以研究同源片段长度对重组修复效率的影响。方法：通过Golden Gate克隆方法构建Cas9表达质粒pKD46-Cas,转化至大肠埃希菌DH5α中,阿拉伯糖诱导表达Cas9蛋白,Western blot检测蛋白表达。用同样的方法,将一段随机靶标序列引入pTac-mCherry-3guid质粒中,造成插入失活,同时在插入序列两侧分别预留0、40、80、120 bp的mCherry编码区overlap序列,构建出含不同长度同源片段的插入失活mCherry荧光报告质粒pQ0、pQ40、pQ80、pQ120,并将其分别转化到表达Cas9蛋白的大肠埃希菌DH5α中,对应的细菌平板分别为pQ0组、pQ40组、pQ80组及pQ120组,每组各9个平板,对每个平板的红、白色菌落进行计数,分别计算出红色菌落数/菌落总数的比值,即为重组修复效率。结果：PCR及测序证实pKD46-Cas质粒及插入失活的mCherry荧光报告载体pQ0、pQ40、pQ80、pQ120构建成功,Western blot鉴定pKD46-Cas在大肠埃希菌DH5α中表达Cas9蛋白;红色菌落计数显示pQ0组为0,其余3组均出现红色菌落,4组重组修复效率的差异有统计学意义（P<0.05）,重组修复效率与同源片段长度呈正相关（r=0.792,P<0.01）。结论：成功建立了基于mCherry红色荧光报告基因和Cas9的同源重组效率检测系统;研究表明不包含同源片段的质粒无法进行有效的重组,当同源片段在0~120 bp时其长度对重组效率有影响。此系统为深入研究原核生物的同源重组提供了一个新的技术平台。     

携带Lipocalin 2基因重组减毒沙门菌的构建及其对分枝杆菌生长影响的研究

目的：探讨携带脂质运载蛋白2（lipocalin 2,Lcn2）的减毒沙门菌对分枝杆菌生长的影响。方法：以巨噬细胞RAW264.7提取RNA逆转录为cDNA为模版,采用PCR法扩增Lcn2基因,定向克隆到质粒pBudCE4.1-orim的多克隆位点中,构建重组质粒 pBudCE4.1-orim-Lcn2;将重组质粒转染RAW264.7细胞,用RT-qPCR法检测Lcn2的mRNA 相对表达量,并以空白载体为对照组;将重组质粒转入减毒沙门菌SL7207得到重组菌株 SL7207-pBudCE4.1-orim-Lcn2;重组菌感染RAW264.7细胞,Western blot检测Lcn2的蛋白表达,RT-qPCR法检测Lcn2的mRNA的相对表达量,并以空载菌组为对照;7H10平板上通过菌落计数观察重组菌对感染 RAW264.7 细胞的卡介苗（Bacille calmette-guerin,BCG）生存的影响,以空载菌组为对照。用重组菌灌胃小鼠,检测脾组织Lcn2和血清IFN-γ水平,以空载菌和生理盐水为对照组。结果：PCR扩增出Lcn2基因;重组质粒经双酶切及基因测序鉴定正确。重组菌感染 RAW264.7细胞Lcn2的蛋白表达量较对照组增加（P=0.000）。RT-qPCR 法检测重组菌、重组质粒Lcn2 mRNA表达较对照组明显升高（P=0.000,F=5.281;P=0.000,F=22570）。7H10平板上重组菌组BCG数量与空载菌组相比明显减少（P=0.000,F=11.41）。重组菌组与空载对照菌组相比小鼠脾组织 Lcn2表达升高（P=0.000,F=4.449）,重组菌组与生理盐水组血清IFN-γ升高（P=0.004,F=15.27）。结论：成功构建了携带Lcn2基因的重组减毒沙门菌。重组菌感染RAW264.7细胞后Lcn2的表达增加,对感染RAW264.7的BCG存活起到一定的抑制作用。重组菌灌胃后小鼠脾组织Lcn2表达增加,血清IFN-γ含量增加,小鼠免疫状态有利于结核病转归。该研究为进一步研究脂质运载蛋白和结核分枝杆菌感染的关系及分子机制打下基础。     

结核分枝杆菌RpfA蛋白的原核表达、鉴定和纯化

目的:构建结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)复活促进因子A(Resuscitation-promoting factor,ARpfA)的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出RpfA基因(1 224bp),然后用双内切酶消化后,与同样酶消化的pET32aα( )载体连接,转入大肠杆菌Top10;阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定.测序正确后,将重组质粒转化到的大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导,由盯启动子调控表达了RpfA蛋白;利用His-tag in-gel Stain对表达蛋白进行鉴定,最后对目的蛋白进行纯化.结果:双酶切鉴定所切下的片段大小与理论值相符,测序结果与文献报道一致.经SDS-PAGE分析和His-tag in-gel Stain鉴定均发现66ku处有特异性蛋白条带.结论:成功克隆并构建了RpfA基因的重组表达质粒pET32 α( )-RpfA,并获得了高纯度的重组蛋白,为以后的深入研究奠定了基础.     

夏枯草硫酸多糖下调miR-886-5p对肺结核模型大鼠的干预效果及作用机制

目的 研究夏枯草硫酸多糖下调miR-886-5p对肺结核模型大鼠的干预效果及作用机制。方法 50只大鼠随机选取10只为正常组,其余40只建立肺结核模型,喂养4 w后每组随机抽样2只,取肺组织苏木素-伊红(HE)染色,发现肺组织可见大量炎性细胞浸润为建模成功。建模成功后将建模成功的38只大鼠分为模型组(14只)、低剂量组(12只)、高剂量组(12只)。低剂量组给予夏枯草硫酸多糖60 mg/kg,高剂量组给予夏枯草硫酸多糖100 mg/kg,均4 d/1次,共3次。正常组、模型组给予生理盐水。各组均连续灌胃2 w。对比分析各组miR-886-5p、氨基转移酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6水平及转化生长因子(TGF)-β1/Smad3通路蛋白表达量。结果 相比与正常组,模型组、低剂量组、高剂量组miR-886-5p、ALT、AST、TNF-α、IL-6水平显著升高(P<0.05);与模型组相比,低剂量组、高剂量组miR-886-5p、ALT、AST、TNF-α、IL-6水平显著降低(P<0.05);与低剂量组相比,高剂量组mi...     

稳定表达细胞内病原体抗性基因1的RAW264．7细胞克隆的建立

目的：构建携带细胞内病原体抗性基因1（1pr1）,以绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因的重组真核表达载体,并导人鼠巨噬细胞RAW264．7中表达．方法：KpnⅠ和BamHⅠ双酶切重组质粒pET32a（＋）-Ipr1及真核表达载体pEGFP-C1,Ipr1基因定向克隆人pEGFP-C1载体,构建重组质粒载体pEGFP-C1-Ipr1．脂质法转染体培养的RAW264．7细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察pEGFP-C1-Ipr1融合蛋白在细胞中的表达;PCR检测Ipr1基因转录水平的表达;West-ernBlot方法验证Ipr1蛋白水平的表达．结果：酶切鉴定获得一条约4700bp空载体条带及一条约1338bp目的片段,证明pEGFP-C1-Iprl真核表达载体构建成功．pEGFP-C1-Ipr1转染RAW264．7细胞后,WesternBlot可以检测到约Mr77×10^3的融合蛋白在RAW264．7细胞中表达,荧光显微镜下可观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达．结论：成功构建真核绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-Ipr1,获得稳定的RAW264．7-Ipr1细胞克隆可表达Ipr1,为进一步研究Ipr1的功能奠定了基础．     

人脂质运载蛋白2研究进展

人脂质运载蛋白2(lipocalin 2,Lcn2),属于Lcn家族的新成员.它存在于人体许多正常组织细胞中,可作为运铁蛋白介导转铁途径,并与免疫炎症反应、肿瘤发生发展以及肾脏疾病有关.