EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤,酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性,流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能,Fortebio测定抗体亲和力,抗体全长测序,经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment,scFv);人EGFR单克隆抗体杂交瘤系,经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因,构建scFv,克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接,克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,FACS测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况,转染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3,具备高度配受体封阻性能,经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10 -10 mol/L),EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2),其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-scFv,检测培养上清存在PD-L1-ScFv;CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达,双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。     

吸烟肺癌患者尿中烟草特有亚硝胺4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶）-1-丁酮代谢产物的测定

摘要目的国外研究表明：不论以何种方式以烟草特有亚硝胺4-(甲基亚硝胺基)-1-(3吡啶)-1-丁酮(4-(methylni-trosamlno)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，NNK)处理小鼠均能特异地诱发小鼠肺癌，且多为肺腺癌，NNK是公认的吸烟者患肺癌的-个病因。本研究拟通过测定吸烟者尿中NNK的代谢产物4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶）-1-丁醇(4-(methylnltrosamlno）-1-(3-pyridyl)-1-butanol，NNAL）及其解毒产物4-(甲基亚硝胺基)-1-(3吡啶-N-氧化物)-1-丁醇(4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl-N-oxide)-1-butanol，NNAL-Gluc)的含量及NNAL-Gluc／NNAL的比值来了解NNK特异的致肺癌性。方法 用高压液相色谱仪(HPLc)和气相色谱-双极质谱联用仪(Gc-MS／MS)对18例吸烟者和2例不吸烟者的24小时尿样进行分析。结果 NNAL和NNAL-Gluc的测定量与国外研究的结果相类似，吸烟者的尿中均测到了NNAL和NNAL-Gluc。不吸烟者的尿中均未测到NNAL和NNAL-ghc。结论 首次在中国吸烟者的尿中测到了NNK的代谢产物和其解毒产物，建立了在吸烟者尿中测定NNK的代谢产物NNAL及NNAL-Gluc的方法，对我们了解烟草有关肺癌的发病机制有着重要的意义。     

脑心通胶囊联合康复护理对脑外伤患者上肢功能的影响

目的观察脑心通胶囊联合康复护理对脑外伤患者上肢功能的影响。方法患者随机分成治疗组和对照组,试验组于脑外伤后1月加服脑心通胶囊并予康复护理,对照组予安慰剂和常规护理。观察时间为8周。比较两组治疗前后简易上肢机能检查(STEF)、简化Fugl-Meyer上肢运动功能评分(FMA)及改良Barthel指数(MBI)评分的差别。结果治疗8周后,两组患者STEF、FMA及MBI评分均较治疗前明显好转(P<0.01);并且上述指标均以试验组的改善幅度相对较显著,两组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论脑心通胶囊联合康复护理有助于上肢功能恢复。     

支气管灌洗液抑癌基因过甲基化对肺癌诊断价值的研究

目的探讨支气管灌洗液抑癌基因过甲基化对肺癌诊断的应用价值。方法选取北京市结核病胸部肿瘤研究所收治怀疑肺癌患者78例,包括肺癌51例和良性病变患者27例,从支气管灌洗液上清和细胞提取DNA,对上清游离DNA进行定量分析,并采用NMSP完成对支气管灌洗液上清和细胞的过甲基化分析,所选择的靶基因包括p16,MGMT以及RASSF1A基因。将NMSP结果与临床诊断比较,计算敏感性和特异性。结果中心型肺癌、周围型肺癌和肺部良性病变支气管灌洗液上清游离DNA含量没有显著差异。支气管灌洗液细胞抑癌基因过甲基化诊断中心型肺癌的敏感性和特异性分别为85.2%和81.5%,诊断周围型肺癌的敏感性和特异性分别为54.2%和81.5%。支气管灌洗液上清和细胞抑癌基因过甲基化诊断中心型肺癌的敏感性和特异性为88.9%和70.4%,诊断周围型肺癌的敏感性和特异性为75.0%和70.4%。结论支气管灌洗液抑癌基因的过甲基化可为肺癌诊断提供帮助。     

天然调节T细胞与结核病免疫病理关联

目的 检测调节性T细胞(Tr)在结核病病人是否增高,确证Tr与结核免疫病理的关联性,为Tr功能研究提供疾病模型.方法 流式细胞术(FACS)分选CD3+CD4+T及CD3+CD8+T等主要淋巴细胞亚群,通过RT-PCR测定Foxp3基因在正常和结核病病人T细胞亚群中的表达,FACS多色分析Foxp3 T细胞在CD4+CD25+细胞群体中的分布,累积病例分析Tr细胞在外周血扩增情况,免疫组化方法分析Tr在结核病理的浸润,结合临床资料分析Tr数量的改变与结核病的关联性.结果 Foxp3基因在正常和结核病病人CD3+ CD4+T细胞中特异性扩增,FACS分析表明foxp3主要表达于CD4+ CD25high亚群中,占CD4+ CD25highT细胞的80%以上,以CD4+CD2high Foxp3+三联标志检测40例正常与51例活动性结核病病人外周血Tr占CD4+T细胞比例分别为(0.23±0.20)%和(1.01±1.00)%,结核病病人较正常人高4.4倍,Tr在结核病明显扩增(P<0.01),结核病理组织中有高频率Foxp3+细胞浸润.Tr扩增与结核病有效治疗和预后的关联性有深入探讨价值.结论 Tr细胞在结核病病人增高,并与结核免疫病理损伤相关,结核病可作为Tr细胞功能研究的疾病模型.     

小鼠4-1 BB分子的配体识别主要区域定位及结构分析

目的 明确4-1 BB分子的配体结合4-1 BB分子胞外区的关键区域和基本结构.方法 分区表达鼠4-1 BB胞外区结构域及其天然配体,利用ELISA和Western blot等方法 对4-1 BB分子的配体识别结构域进行定位.结果 4-1 BB分子半胱氨酸寓集结构域(cysteine-rich domain,CRD)Ⅱ是配体结合的主要结构域,不结合CRD Ⅰ和CRDⅢ.免疫刺激性抗4-1 BB单克隆抗体2A,主要结合4-1 BB分子CRD与跨膜区之间的连接区(STP区),同时对包括CRDⅡ的各个CRDs有弱识别,可封阻4-1 BB与其配体结合.结论 4-1 BB分子配体的主要识别区位于4-1 BB分子胞外CRD Ⅱ,具有空间结构特点,此为进一步分析结合区及其关键氨基酸提供了资料.     

吸烟肺癌患者尿中烟草特有亚硝胺4-(甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶)-1-丁酮代谢产物的测定

背景与目的国外研究表明不论以何种方式用烟草特有亚硝胺4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶）-1-丁酮[4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone，NNK]处理小鼠均能特异地诱发小鼠肺癌，且多为肺腺癌，NNK是公认的吸烟者患肺癌的一个病因。本研究的目的是通过测定吸烟者尿中NNK的代谢产物4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶）-1-丁醇[4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanol，NNAL]及其解毒产物4-（甲基亚硝胺）-1-（3-吡啶-N-氧化物）-1-丁醇E4-（methylnitrosamino）-1-（3-pyridyl—N—oxide）一1一butanol，NNAL-Gluc]的含量及NNAL，Gluc／NNAL比值来了解NNK特异的致肺癌性。方法 用高压液相色谱仪（HPLC）和气相色谱-双极质谱联用仪（GC—Ms／MS）对10例吸烟肺癌患者、8例健康吸烟者和4例健康不吸烟者的24h尿样进行分析。结果 不吸烟者的尿中未测到NNAL和NNAL-Gluc，健康吸烟者尿中平均NNAL-Gluc／NNAL比值为4．95，吸烟肺癌患者为0．5。结论 建立了在吸烟者尿中测定NNK代谢产物NNAL及NNAL-Gluc的方法。初步研究显示健康吸烟者对NNK的解毒能力明显大于吸烟肺癌患者，为在吸烟人群中筛选肺癌高危人群提供了检测手段。     

SPLUNC1-Ig融合蛋白在CHO细胞中的稳定表达及活性初步分析

目的 构建短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)-Ig融合蛋白表达体系并初步分析其活性.方法 在质粒PGEM-T easy-SPLUNC1基础上联合应用大引物法和巢式PCR实现目的序列147位碱基的定点突变,亚克隆于表达载体PDH3,构建PDH3-SPLUNC1的表达质粒.稳定转染CHO/dhfr-细胞完成SPLUNC1-Ig融合蛋白的表达,并在氨甲喋呤(MTX)加压下筛选出稳定表达的细胞株,应用ELISA检测蛋白表达的水平.利用蛋白A亲和层析系统纯化获得的SPLUNC1-Ig融合蛋白,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹进行鉴定,经ELISA、Western免疫印迹分析SPLUNC1-Ig融合蛋白的特异性和活性.结果 经酶切及测序结果证实预定位点已突变,琼脂糖凝胶电泳出现大小为768 bp的目的条带;测序发现SPLUNC1基因的147位碱基A均已突变成C,证实PDH3-SPLUNC1表达质粒构建成功.RT-PCR扩增出768 bp大小的SPLUNC1基因.ELISA检测CHO/dhfr-细胞上清表明SPLUNC1-Ig融合蛋白在3个月内稳定表达,水平与时间的延长无关.经亲和层析获得SPLUNC1-Ig融合蛋白,SDS-PAGE电泳可见相对分子质量约52 500大小的条带.Western免疫印迹也在45 000与66 200之间出现与预测位置相符的特异目的条带.SPLUNC1-Ig融合蛋白浓度为0.39 mg/L时与脂多糖结合活性明显高于阴性对照,6.25 mg/L时与脂多糖结合的A450值基本达到平台期.Western免疫印迹也显示未变性的脂多糖可与SPLUNC1-Ig融合蛋白结合,而变性后却不能与之结合.结论 建立了非切胶纯化的定点突变方法,顺利实现了表达质粒的构建.成功构建SPLUNC1-Ig融合蛋白表达体系,其分泌的目的蛋白具有蛋白的天然结构和体外活性.     

天然免疫相关蛋白分子SPLUNC1载体构建及蛋白稳定表达

固有免疫应答在保护机体避免细菌感染中发挥着重要作用,如果固有免疫应答出现紊乱,则会加重感染和炎症反应。在呼吸道,黏膜分泌的多种蛋白如杀菌性/通透性增强蛋白(bactericidal/permeabilityincreasing protein,BPI)等能够通过参与固有免疫应答来清除呼吸道入侵的细菌,避免呼吸道感染[1]。短上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1(short palate lung