hTRX PR39融合基因cDNA克隆的构建及鉴定

目的研究人硫氧还蛋白（hTRX）和抗菌肽PR39基因在脑缺血疾病治疗中的作用,构建hTRX PR39cDNA融合基因。方法设计合成PR39、hTRX正向和反向引物,采用PCR方法,扩增获得两端具有BamHI和Ecor721、Eco721和EcoI酶切位点的PR39 cDNA和hTRX cDNA片段,并分别克隆到pGEM T easy中,转化细菌,筛选阳性克隆,酶切鉴定并测序。BamH I和EcoR721双酶切pGEM T hTRX和pGEM T PR39,将获取的PR39/BamHI,EcoR721片段克隆到pGEM T hTRX/BamHI,EcoR721载体中,构建pGEM T hTRX PR39载体。结果经DNA测序证实,修饰过的hTRX cDNA、PR39 cDNA片段的核酸序列和推导的氨基酸同数据库资料一致。重组质粒pGEM T hTRX PR39酶切图谱证实hTRX PR39融合肽cDNA已克隆到pGEM T表达载体中。结论成功克隆出具有EcoR721和EcoRI、BamH I和EcoR721酶切位点的hTRX cDNA和PR39 cDNA片段,并构建pGEM T hTRX PR39载体。     

丙型肝炎病毒核心区基因在大肠杆菌中的高效表达

丙型肝炎病毒(HCV)是输血后及散发性非甲非乙型肝炎的主要病原,丙型肝炎易转为慢性肝炎,与肝癌及肝硬变关系密切。HCV核心区编码蛋白是研究重点之一。在研究过程中,首先应获得大量高效表达的HCV核心蛋白抗原。HCV基因组结构与黄病毒或瘟病毒相似,为长约9.4kb的单股正链RNA,含一个开放读码框架(open reading frame,OFR),编码含3010～3011个氨基酸残基的多蛋白前体,经宿主和病毒蛋白酶作用加工成结构蛋白(C,E1和E2/NS1)和非结构蛋白(NS2,NS3,NS4和NS5)。核心蛋白约含191个氨基酸,大小约19000～22000,其氨基酸序列十分保守,比较已有的HCV各分离株氨基酸序列,同源性超过95％。其N端三个亲水区的优势抗原表位主要是线性抗原决定簇,在此免疫优势区内出现的变异对免疫识别并没有很大影响。由于人感染HCV后,血清中     

hTRX-PR39重组腺相关病毒载体的构建

目的 探讨hTRX-PR39融合基因在脑缺血疾病中的治疗作用。方法 将已经构建好的hTRX-PR39融合基因插入到具有相应酶切位点的pSSCMV病毒载体质粒中,得到重组腺相关病毒载体质粒,酶切电泳鉴定。将已构建的重组腺相关病毒载体质粒、腺病毒辅助质粒PFG140和包装质粒pAAV/Ad,三质粒磷酸钙共沉淀法转染293细胞系,通过同源重组获得hTRX-PR39重组腺相关病毒载体, 收集病毒, 斑点杂交（Dot blot）法测定病毒滴度。结果 成功构建重组腺相关病毒质粒pSSCMV/ hTRX-PR39。包装、回收病毒后,Dot blot法测定重组病毒滴度为3.46×(1012~1013)PFU/mL。结论 成功构建pSSCMV/ hTRX-PR39重组腺相关病毒载体,并包装较高浓度的重组病毒。     

人神经营养素-4成熟蛋白基因克隆

本研究的目的是克隆人神经营养素-4成熟蛋白基因(mhNT-4)并进行序列分析。应用PCR技术,以正常人血淋巴细胞染色体DNA为模板,扩增出人神经营养素-4(hNT-4)成熟蛋白编码基因。将所得基因片段重组于pGEM-T Easy质粒,筛选得到含人mhNT-4基因的阳性克隆。采用Sanger单链末端终止法测出全部的核苷酸序列。所得到的序列与国外文献所报道的结果(GenBank,M86528)完全相同。mhNT-4成熟蛋白基因的成功克隆,为研究其在原核细胞中的表达提供了有利条件。本文结果也提示不同人种间及不同个体间hNT-4成熟蛋白基因是相对保守的。     

人骨形态发生蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的表达及其活性测定

目的 利用基因工程技术表达人骨形态发生蛋白4（hBMP4),为深入研究基结构、诱骨机理及临床应用将起积极作用。方法 应用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）技术,扩增出hBMP4成熟区基因,将其克隆于表达载体pBV220的PRPL的启动子下游。分别经随机挑选、限制性内切酶酶切鉴定及十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰 胺凝胶电泳（SDS－PAGE）筛选证实得到5株重组粒pBV/BMP4的转化菌株,以非融合蛋白形式表达hBMP4。结果 DS－PAGE显示,此蛋白相对分子量为14,表达量占菌体蛋白15.6%;细胞培养碱性磷酸酶（ALP）活性测定证明,细胞分泌ALP的活性与rhBMP4浓度呈剂量依赖关系。结论 hBMP4在大肠杆菌中的表达产物复性后具有生物学活性,确证为hBMP4蛋白。