Realtime-PCR动态检测巨细胞病毒在肾移植术后的临床应用

目的探讨巨细胞病毒(C M V)D N A检测在肾移植术后C M V病预防中的作用。方法采用R ealtim e-PC R定量检测肾移植受者外周血白细胞中C M V-D N A,术后4月内每周1次。结果95例患者中有55例检出C M V-D N A阳性(57.9%),初次检出C M V-D N A的平均时间为(25.6±16.3)d,C M V-D N A的平均拷贝数为(1396.4±445.2)/105白细胞。在随访过程中,18例患者的C M V-D N A水平超过警戒线—800copy/105白细胞,经调整免疫抑制剂后,均降至警戒线以下,所需平均时间为(16.3±8.5)d。所有患者均未出现C M V病。结论C M V-D V A检测可用于预防肾移植术后C M V病的发生。     

L-ficolin基因Thr236Met位点多态性与儿童反复呼吸道感染的相关性

目的 探讨中国江苏汉族儿童L-ficolin基因Thr236Met位点多态性与反复呼吸道感染的相关性.方法 采用碱基淬灭探针技术检测104例反复呼吸道感染患儿及214例对照组儿童L-ficolin基因Thr236Met位点多态性.结果 L-ficolin基因Thr236Met多态性基因型和等位基因频率分布在反复呼吸道感染组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 中国江苏汉族儿童反复呼吸道感染的发病与L-ficolin基因Thr236Met位点多态性没有关联.     

Cystatin M在乳腺癌中的表达及其临床意义

目的 了解cystatin M在乳腺肿瘤中的表达及其临床意义.方法 采用实时定量PCR检测52例乳腺肿瘤标本及邻近正常乳腺组织中cystatin M mRNA及内参GAPDH表达水平,分析cystatin M基因表达与临床病理参数的关系.结果 乳腺癌标本的cystatin M含量与其周围邻近的正常乳腺组织及良性肿瘤中表达cystatin M含量无统计学意义;但发生淋巴结转移的乳腺肿瘤标本的cystatin M则明显低于其周围邻近的正常乳腺组织(P＜0.05),也明显低于未发生淋巴结的乳腺肿瘤标本(P＜0.05);乳腺癌标本cystatin M表达水平与乳腺癌病人的雌激素受体状态(ER)及孕激素状态(PR)无关.结论 Cystatin M是一种监测乳腺癌是否发生转移的一种可靠的指标.     

实时荧光定量PCR检测MT2-MMP在肺癌中的表达及其临床相关性

目的建立实时荧光定量PCR检测肺癌组织中膜型基质金属蛋白酶2(MT2-MMP)基因表达的方法,并探讨MT2-MMP的临床相关性。方法肺癌组织及癌旁正常组织取自21例非小细胞肺癌手术患者。设计人MT2-MMP、内参照β-actin基因的引物及Taq Man探针,将MT2-MMP及β-actin基因扩增片段纯化后分别构建重组质粒,制备标准品。检测肺癌及癌旁正常组织中MT2-MMP及β-actin的基因表达水平,并分析其临床相关性。结果经测序验证,PCR扩增产物为MT2-MMP及β-actin基因的特异片段。MT2-MMP、β-actin基因表达灵敏度分别为600拷贝/ml、300拷贝/ml,线性范围分别为6×102~6×107拷贝/ml、3×102~3×107拷贝/ml,相关系数均为1.000,扩增效率分别为88.1%、86.2%,批间变异系数分别为0.40%~1.55%、0.59%~3.98%。MT2-MMP在肺癌组织中的基因表达水平显著高于癌旁正常组织(P<0.05),但与患者临床病理参数无相关性。结论成功构建了检测人MT2-MMP的实时荧光定量PCR方法,该法特异性好,灵敏度高;MT2-MMP可能参与肺癌的...     

实时荧光定量PCR检测人apoM方法的构建

目的 建立检测人载脂蛋白M(apoM)的实时荧光定量PCR技术.方法 采用Primer Express Versions 2.0设计引物及TaqMan探针,检测apoM基因.将扩增的apoM基因片段纯化后与pMD19-T载体连接,克隆构建含apoM基因片段的重组质粒,作为定量检测apoM基因表达的标准品.结果 PCR扩增产物经测序分析证实为apoM特异性片段.本法灵敏度为40 copies/μl,线性范围为4.00×10~1～4.00×10~8copies/μl,相关系数为1.000,扩增效率E为90.5%,批间变异系数为6.38%～17.9%.结论 成功建立了检测人apoM的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好,灵敏度高.     

雌激素通过雌激素受体上调载脂蛋白M表达

目的 研究雌激素对载脂蛋白M的影响.方法 采用RT-PCR法检测不同浓度、不同作用时间雌激素处理HepG2细胞以及雌激素和雌激素受体拮抗剂共同处理后,HepG2细胞载脂蛋白M mRNA的表达:将SD雌性大鼠分为5组:去卵巢组(0VX)；假手术组(Sham)；去卵巢+苯甲酸雌二醇(EB)组(OVX+EB)；正常大鼠组(对照组)；正常大鼠+EB组(EB组),术后给予不同剂量的EB.常规生化检测血液标本中血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL),RT-PCR和Western印迹检测鼠apoM表达.结果 雌激素上调HepG2细胞载脂蛋白M的表达,这种效应呈剂量和时间依赖性,可以被ER拮抗剂抑制.术后第1个月,OVX+EB组和EB组大鼠apoM mRNA水平以及血清apoM 、HDL、总胆固醇、甘油三酯和LDL水平分别较OVX组和对照组大鼠有显著性升高(P＜0.05).结论 雌激素通过ER途径上调载脂蛋白M的表达.     

肾移植受者外周血循环中pp65阳性内皮细胞的新模式

目的：为了观察感染人类巨细胞病毒（Human cytomegalovirus HCMV）的1例女性肾移植外周血中膨大内皮细胞（Cytomegalic endothelial cells,CEC)的一种新模式。方法：本研究运用了HCMV pp65抗原分析法，实时PCR技术、流式细胞分析法等系列技术。结果：发现这一围绕并粘附了许多白细胞的蛋白样物质内，含有几个pp65阳性的CEC。这种蛋白质样物质的成分和功能目前还不清楚。该患者外周血中出现CEC表明其血管有损伤，而且该患者的CD4^ 及CD8^ 淋巴细胞的百分比都超出正常范围。其血浆、外周血白细胞及尿液中的HCMV-DNA都阳性，但该患者并没有明显的HCMV病症状。结论：HCMV感染和CEC形成之间的关系需进一步研究。     

女性生殖道中生殖支原体感染的调查

生殖支原体（Mycoplasma genitalium Mg）是在人、畜中均致病的一种支原体,它可以引起雌性和雄性动物的泌尿生殖道炎症,并与人类的男女性泌尿生殖道炎性疾病相关。以往的研究主要集中在对生殖道分泌物进行检测,但对相关组织进行检测的报道较少,为此我们将这两者结合起来,采用简便、敏感、特异的套式PCR法。检测女性生殖道分泌物（211份）和组织（231份）中Mg16SrRNA基因的表达情况,探讨Mg的感染与女性生殖道炎症的关系,现报告如下。     

ShineRoar探针技术检测单核苷酸多态性

目的建立一种低成本、高效率、操作简便的单核苷酸多态性（SNP）检测技术。方法采用自行设计的“ShineRoar探针”，结合融解曲线技术检测目的基因SNP。并根据其工作原理分别对肿瘤坏死因子受体Ⅱ（TNFRⅡ）和载脂蛋白M（apoM）的基因多态性进行检测；同时用DNA测序技术鉴定ShineRoar探针技术的准确性。结果融解曲线分析结果显示，某一基因的野生型及突变型纯合子分别在2个不同的融解温度出现融解谷。TNFRⅡ基因第6外显子196位突变（ATG→AGG）所产生的T和G等位基因的融解温度分别为（52．84±0．75）℃和（58．38±0．61）℃；apoM T-778C突变所产生的T和C等位基因的融解温度分别为（42．55±0．73）℃和（49．19±0．57）℃。一致性Kappa检验显示ShineRoar探针技术与DNA测序技术的SNP检测结果一致（Kappa=1，P=0．000）。结论ShineRoar探针技术简单、快速、准确，适用于大批量基因分型的研究。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测人锌指蛋白23方法的构建

目的建立检测人锌指蛋白23(human zinc finger 23,ZNF23)的实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术。方法采用Primer Express Versions 3.0设计引物及TaqMan探针,检测ZNF23基因。将扩增的ZNF23基因片段纯化后与pMD19-T载体连接,克隆构建含ZNF23基因片段的重组质粒,作为定量检测ZNF23基因表达的标准品。结果 PCR扩增产物经测序分析证实为ZNF23特异性片段。本法灵敏度为650 copies/μL,线性范围为(6.50×102)-(6.50×107)copies/μL,相关系数R2为0.999,扩增效率E为97.28%,批间变异系数为0.78%～7.53%。结论成功建立了检测人ZNF23的实时荧光定量PCR方法,且该方法特异性好、灵敏度高、通量高。