人IL-1β重组表达载体在肝癌细胞的表达及对其NK细胞杀伤敏感性的影响

目的：构建全长人IL-1β真核表达载体,转染H7402肝癌细胞,分析对其NK细胞杀伤敏感性的影响。方法：RT-PCR法扩增人IL-1β基因全长编码序列,经T-A克隆,构建pIRES2-EGFP-IL-1β重组表达载体,采用阳离子聚合物jetPEI的方法转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,RT-PCR分析IL-1β的表达水平,MTT方法分析转染前后NK细胞对肝癌细胞杀伤活性的变化。结果：从LPS处理的人外周PBMCs总RNA中扩增出IL-1β（大小约829 bp）,先构建pMD18-IL-1β克隆载体,DNA序列鉴定正确后,利用Pfu DNA聚合酶将IL-1β基因亚克隆到pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-IL-1β,经PCR、限制性酶谱分析（BamHⅠ和EcoRⅠ）和DNA序列测定正确后,将其转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达IL-1β的细胞,与转染空载体的细胞相比,该细胞对NK-92细胞杀伤的敏感性显著降低,效靶比10∶1时下降了约30%。结论：促炎性细胞因子IL-1β能够显著增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是导致肝癌细胞发生天然免疫逃逸的重要机制。     

人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)原核表达及初步应用

目的:克隆人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)基因并构建原核表达载体,用纯化的重组蛋白进行系统性硬化症(SSc)体外诊断应用研究.方法:从体外培养的HeLa细胞中提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hnRNP I基因,构建原核表达载体pET-30a-hnRNP I,在原核表达系统E.coli BL21(DE3)中表达重组蛋白.重组蛋白纯化后作为抗原对包括系统性硬化症(SSc)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、混合型结缔组织病(MCTD)、未分化型结缔组织病(UCTD)、类风湿性关节炎(RA)、正常对照(control)在内的血清相应抗体进行ELISA检测.结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-hnRNP I,在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(M_r)为59 600的重组hnRNP I蛋白,重组蛋白可以可溶蛋白和包涵体蛋白两种形式存在.hnRNP I蛋白抗体在SSc中阳性率(48.72%)明显高于其他各组(P<0.05).结论:利用构建的原核表达载体成功表达出hnRNP I蛋白,此重组蛋白可用于SSc的临床诊断检测. UCTD) 类风湿性关节炎(RA)、正常对照(control)在内的血清相应抗体进行ELISA检测.结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-hnRNP I,在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为59 600的重组hnRNP I蛋白,重组蛋白可以可溶蛋白和包涵体蛋白两种形式存在.hnRNP I蛋白抗体在SSc中阳性率(48.72%)明显高于其他各组(P<0.05).结论:利用构建的原核表达载体成功表达出hnRNP I蛋白,此重组蛋白可用于SSc的临床诊断检测. UCTD) 类风湿性关节炎(RA)、正常对照(control)     

分泌型人IL-1β表达载体的构建及在H7402细胞中的表达

目的构建经典途径分泌型人白细胞介素1β(shIL-1β)重组表达载体,检测其在H7402肝癌细胞中的表达。方法采用SOE方法将人红细胞生成素(EPO)信号肽序列和编码人白细胞介素(hIL-1β)成熟蛋白的基因序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建shIL-1β真核表达载体pIRES2-EGFP-shIL-1β,利用jetPEI方法将其稳定转染H7402细胞(H7402／shIL-1β),荧光显微镜及RT-PCR检测融合基因的表达水平,间接ELISA方法测定培养上清hIL-1β分泌水平。结果荧光显微镜下观察可见H7402／shIL-1β细胞发出明亮绿色荧光,RT-PCR检测显示pIRES2-EGFP-shIL-1β能够在H7402细胞中稳定表达融合基因mRNA,同时细胞培养上清中hIL-1β表达水平明显上升。结论成功构建了经典途径分泌的hIL-1β重组表达载体,该载体可在H7402细胞中稳定分泌生物活性的hIL-1β。     

关于本科生医学免疫学启发式教学的探讨

针对医学免疫学理论抽象、逻辑性强、学生感觉枯燥难懂的特点,介绍了启发式教学及其实施的三个阶段,同时指出该教学方式具有效激发学生的学习兴趣,培养独立思考和创新意识,提高教学质量的作用.     

过敏性腹泻小鼠大肠黏膜中T细胞亚群的表达与Th1/Th2型细胞因子的关系

目的 检测小鼠过敏性腹泻模型大肠黏膜中T细胞亚群的表达和血清中Th1型细胞因子(IFN-γ)、Th2型细胞因子(IL-4)和OVA-IgE水平,探讨腹泻小鼠大肠黏膜中T细胞亚群的表达特点与Th1/Th2型细胞因子的关系.方法 雌性BALB/c小鼠20只随机分成两组,即对照组和实验组.采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IFN-γ,IL-4及OVA-IgE的水平,取大肠组织HE染色观察大肠组织病理改变,免疫组织化学染色观察T细胞亚群的表达情况.结果 与对照组相比,实验组小鼠非特异性炎症反应明显,上皮不规则排列,腺区存在大量白细胞(WBC)浸润,固有层可见大量嗜酸性粒细胞(EOS)浸润.CD3,CD4,CD8免疫组织化学染色显示,与对照组相比,肠黏膜固有层可见大量CD3+,CD4+,CD8+细胞.实验组IL-4,OVA-IgE分泌水平明显升高,IFN-γ分泌水平和IFN-γ/IL-4比值显著降低(P<0.01).嗜酸粒细胞百分比与CD4+/CD8+比值呈显著正相关(P<0.05).结论 过敏性腹泻小鼠大肠黏膜局部CD4+T细胞亚群明显增加,CD4/CD8细胞比例失衡,并与Th1/Th2型细胞因子向Th2型漂移及EOS浸润程度相关.     

IL-1β反义RNA在HepG2细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

目的:构建IL-1β反义RNA真核表达载体,转染HepG2细胞,探讨阻断IL-1β作用后对其NK细胞杀伤敏感性的作用。方法:RT-PCR方法扩增两段基因序列IL-1β1(17-331,315bp)和IL-1β2(246-505,260bp),经T-A克隆后构建反义RNA表达载体pcDNA3.0-antiIL1β1和pcDNA3.0-anti-IL1β2。采用阳离子聚合物(jetPEI)的方法转染HepG2肝癌细胞,RT-PCR方法检测反义RNA的表达水平,胞内因子染色的方法分析IL-1的表达水平,MTT方法分析NK-92细胞对HepG2杀伤活性的变化。结果:以LPS刺激的人PBMC总RNA为模板,RT-PCR扩增得到两个约315bp和260bp的基因片段,先构建克隆载体pMD18T-IL-1β1和pMD18T-IL-1β2,质粒PCR、XhoI酶切和DNA序列分析正确后,利用PfuDNA聚合酶进行PCR,产物纯化后经EcoRI、XhoI双酶切,反向插入pcDNA3.0,获得人IL-1β反义RNA真核表达载体pcDNA3.0-antiIL-1β1和pcDNA3.0-antiIL-1β2。PCR、PstI酶切和DNA序列分析正确后,将其分别转染HepG2细胞,RT-PCR检测显示HepG2细胞能够高水平表达两种反义RNA,胞内因子染色发现IL-1β的表达水平明显下降,同时该细胞对NK-92杀伤的敏感性明显升高,其中IL-1β1反义RNA的作用更为显著,效靶比10∶1时,NK细胞对HepG2的杀伤活性提高了约20%。结论:以促炎性细胞因子IL-1β为靶点进行干预,能够有效地下调肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗能力。     

小鼠分泌型IL-1β真核表达载体的构建及其表达

目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平.方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建分泌型真核表达载体pIRES2-EGFP-smIL-1β,并将其转染至Hepa1-6细胞,RT-PCR检测融合基因的表达水平,'Western blot检测细胞内mIL-1β蛋白的表达,ELISA法测定培养上清及细胞裂解液中mIL-1β水平.结果:经SOE法拼接获得的融合基因与CenBank中登录的序列一致,RT-PCR检测显示该载体能够在Hepal-6细胞中表达融合基因mRNA,细胞培养上清中mIL-1β的分泌水平明显上升,而胞质中的mIL-1β无明显变化.结论:成功地构建了经典途径分泌的mIL-1β重组表达载体,该载体可以在Hepa1-6细胞培养上清中有效分泌具有生物活性的mIL-1β.     

卵白蛋白诱导的急性过敏性腹泻小鼠结肠组织的病理学特征

目的 建立急性过敏性腹泻模型,观察结肠组织的病理学特征.方法 5～6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组;用卵白蛋白（OVA）和完全弗氏佐剂对实验组小鼠隔1周2次腋窝皮下预致敏,第2次致敏1周后2组小鼠均每隔1d给予等量溶解在灭菌PBS的OVA灌胃;于第10次灌胃后处死小鼠,取血分离血清测OVA-IgE,取结肠近端组织行HE染色观察肠组织病理改变并在油镜下计数嗜酸性粒细胞.结果 与对照组相比,实验组小鼠结肠黏膜充血水肿,上皮排列不规则,腺区有大量炎细胞浸润,固有层可见大量嗜酸性粒细胞,血清OVA-IgE水平显著升高.结论 OVA 可诱导过敏性腹泻炎症,结肠黏膜组织以充血水肿和大量嗜酸性粒细胞浸润为特征.     

IL-21在肝癌细胞株H22细胞中的表达及其活性

摘 要　目的：构建小鼠IL-21（mIL-21）真核表达载体mIL-21-pcDNA3.1,转染肝癌H22细胞,探讨其生物学活性。方法：RT-PCR法扩增mIL-21基因,构建mIL-21真核表达载体mIL-21-pcDNA3.1,并经DNA测序证实。脂质体法介导mIL-21-pcDNA3.1转染H22细胞,RT-PCR和Western boltting鉴定其表达,MTT法检测mIL-21-pcDNA3.1对T细胞增殖和NK细胞杀伤活性的影响。结果：DNA序列分析证实构建的mIL-21-pcDNA3.1正确无误,RT-PCR和Western boltting证实转染的H22细胞中有mIL-21的表达。MTT法显示,转染mIL-21的H22细胞培养上清刺激T细胞增殖的刺激指数（stimulation index,SI）为3.412±0.312,联合ConA的刺激指数为4.673±0.450,均显著高于转染空质粒组的1.465±0.103和未转染组的1.447±0.245,(P<0.01）。转染mIL-21的H22细胞培养上清NK细胞杀伤率为(81.66±4.26)%,显著高于转染空质粒组的（34.74±5.52)%和未转染对照组的（33.61±1.42)%。结论：mIL-21-pcDNA3.1载体在H22细胞中的表达可显著增强T细胞增殖及NK细胞的杀伤功能,为其在抗肝癌治疗中的应用奠定了基础。     

丁地去炎松加优喘平治疗非急性发作期重度哮喘的临床观察

近年的研究表明,茶碱除能舒张支气管平滑肌外,还具有气道抗炎和免疫调节作用[1]。我们采用吸入表面激素加缓释型茶碱的方法,治疗非急性发作期重度哮喘,取得了较好的临床效果,现报道如下。1　资料与方法1.1　病例选择　选择非急性发作期重度哮喘患者92例,诊断符合中华医学会呼吸系病学会制定的诊断标准[2],所有病例均为1997年3月至1998年8月住院患者。入选病例均符合下列条件:①已连续服用泼尼松10ｍｇ/ｄ(或更大剂量)12个月以上;②血皮质醇浓度低于正常范围;③未曾应用吸入型糖皮质激素。以下情况均不入选:①对茶碱过敏;②患有消化道溃疡、…