带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用

目的：探索带有HPV-16 E6/E7基因的树突状细胞（dendritic cell,DC）疫苗对裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的抗肿瘤作用。方法：体外诱导培养C57BL/6小鼠骨髓的未成熟DC（immature DC,imDC）,将已经成功构建的携带人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）-16 E6/E7基因的重组腺病毒感染imDC,Western blot检测E7蛋白的表达;构建裸鼠的人宫颈癌CaSki细胞移植瘤模型,应用DC疫苗诱导的BALB/c小鼠脾脏的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）处理后,观察裸鼠肿瘤体积变化,肿瘤长出第28天后处死裸鼠,小心剥下肿瘤组织,石蜡包埋,HE染色观察各组肿瘤的细胞形态,免疫组织化学技术法检测肿瘤组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达情况。结果：成功培养出DC并制备出DC疫苗;第28天各组裸鼠肿瘤体积pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组与pAd-mock-DC-CTL-CaSki组、DC-CTL-CaSki组、CaSki组相比较,pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组裸鼠肿瘤体积最小（P<0.05）;免疫组化检测肿瘤组织中Bax蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最高,而CaSki组表达最低;免疫组化检测肿瘤组织中Bcl-2蛋白的表达结果显示pAd-E6/E7-DC-CTL-CaSki组最低,而CaSki组表达最高。结论：带有HPV-16 E6/E7DC疫苗能够诱导CTL抑制裸鼠人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的生长。     

YAP干扰腺病毒载体对宫颈癌增殖、迁移及侵袭的影响

目的 探索YAP蛋白对宫颈癌细胞的恶性增殖、迁移及侵袭性的作用.方法 分别以腺病毒靶向YAP干扰载体(pAd-si-YAP)、重组空载体腺病毒(pAd-mock)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)感染CaSki细胞.采用定量聚合酶链反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western blotting)、四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)、流式细胞法、划痕试验以及细胞侵袭试验分别分析感染后CaSki细胞的YAP mRNA表达、YAP蛋白表达、细胞增殖活力、细胞周期及凋亡、细胞迁移能力以及细胞侵袭能力.结果 qPCR结果显示Ad-si-YAP感染CaSki细胞的YAP mRNA表达明显低于pAd-mock感染的CaSki细胞及PBS处理的CaSki细胞[(22.01±0.24)比(80.12±0.31)、(84.18±0.22),P<0.05],表明Ad-si-YAP可以抑制YAP基因转录.蛋白质印迹法结果显示Ad-si-YAP感染CaSki细胞的YAP蛋白表达低于pAd-mock感染的CaSki细胞及PBS处理的CaSki细胞[(0.6±0.018)比(1.5±0.031)、(1.8±0.27),P<0.05].MTT结果显示24 h后pAd-mock感染的CaSki细胞及PBS处理的CaSki细胞增殖明显快于Ad-si-YAP感染CaSki细胞(P<0.05).流式细胞结果显示通过沉默YAP后,CaSki细胞周期停滞于G0/G1期明显增加(P<0.05),同时CaSki细胞增多(P<0.01).划痕试验发现沉默YAP后CaSki细胞的迁移能力下降[(40.01±0.16)比(81.02±0.22)、(86.04±0.31),P<0.05],说明YAP可以促进CaSki细胞迁移.细胞侵袭试验发现沉默YAP后CaSki细胞的侵袭能力下降[(120±4)比(640±3)、(680±4),P<0.05].结论 YAP蛋白的表达可导致宫颈癌细胞的恶性增殖、迁移及侵袭,是应用于宫颈癌综合治疗的一个潜在靶点.     

小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞蛋白表达的分析

目的 利用双向电泳和质谱技术对小鼠骨髓来源未成熟树突状细胞(dendritic cells,DC)表达的蛋白质进行分析.方法 IL-4和GM-CSF诱导未成熟DC的分化,提取细胞总蛋白,定量.双向凝胶电泳分离蛋白质组分,胶体银染显色,PDQuest进行图像分析后选取蛋白点,胶内酶解后MALDI-TOF MS进行肽指纹图...     

乙型肝炎病毒X蛋白对肝细胞L02增殖及GSK3β表达的影响

目的:通过研究乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对人肝细胞株L02细胞增殖、细胞周期以及细胞中糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)表达的影响,探讨乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)相关性原发性肝细胞癌(hepatoccellular carcinoma,HCC)的发生机制。方法:用HBx腺病毒(Ad-HBx)感染人肝细胞株L02细胞后,RT-PCR法检测L02细胞中HBx和GSK3β mRNA表达情况;MTT法检测L02细胞的增殖率变化;FCM法检测细胞周期中各时相所占比例;蛋白质印迹法检测HBx、总GSK3β(total-GSK3β,t-GSK3β)、磷酸化GSK3β(phospho-GSK3β,p-GSK3β)、β-连环素(β-catenin)以及细胞用期蛋白(cyclinD1)等蛋白的表达水平。结果:Ad-HBx感染L02细胞后,HBx的mRNA和蛋白均出现表达,细胞增殖率随着时间的延长而增加;G1期细胞所占比例较对照组减少,S期和G2期细胞比例较对照组增加(P<0.05)。感染Ad-HBx后,t-GSK3β在mRNA和蛋白水平上均无明显变化,而p-GSK3β、β-catenin以及cyclinD1蛋白的表达量增加(P<0.05)。结论:HBx可能通过促进人肝细胞株L02细胞中GSK3β的磷酸化,激活Wnt/β-catenin下游信号通路,从而促进细胞的增殖。     

带有HPV-16 E6/E7基因的DC疫苗抑制裸鼠宫颈癌生长的机制

目的 观察由携带HPV-16 E6/E7基因的树突细胞(dendritic cell,DC)疫苗免疫得到的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在裸鼠体内对官颈癌的抑制作用及相关机制.方法 诱导培养C57B L/6小鼠骨髓的未成熟DC(imDC),将已经成功构建的携带人乳头状瘤病毒(HPV)-16 E6/E7基因的重组腺病毒感染imDC,Western印迹检测E7蛋白的表达;构建裸鼠官颈癌细胞移植瘤模型,应用DC疫苗诱导的CTL处理后,观察裸鼠肿瘤的体积变化;CCK8(cell counting kit8)法检测经DC疫苗免疫的BALB/c小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖;免疫组化法检测裸鼠脾脏组织CD4+T淋巴细胞的表达.结果 成功培养出DC并制备出DC疫苗;第28天各组裸鼠肿瘤体积pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki组与对照组pAd-mock-DC-CTL-CaSki组、DC-CTL-CaSki组、CaSki组相比较,pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki组裸鼠肿瘤体积最小(P＜0.05);CCK8法检测经DC疫苗免疫的BALB/c小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖,结果pAd-E6/E7-DC组淋巴细胞OD值明显高于pAd-mock-DC组、DC组和PBS组(P＜0.01);免疫组化检测各组裸鼠脾脏组织CD4 T淋巴细胞的表达结果显示,pAd-E6E7-DC-CTL-CaSki组CD4表达量最高,pAd-mock-DC-CTL-CaSki组和DC-CTL-CaSki组CD4表达量次之,CaSki组CD4表达量最低.结论 带有HPV-16 E6/E7基因修饰的DC疫苗,能够促进小鼠体内T淋巴细胞的增殖,诱导CTL抑制裸鼠宫颈癌移植瘤的生长.     

八珍汤治疗肺癌化疗致白细胞减少症的临床疗效

目的:探究分析肺癌化疗致白细胞减少症采用八珍汤治疗的临床疗效.方法:选取2019年10月—2020年12月四川省中西医结合医院收治的50例肺癌化疗致白细胞减少症患者作为研究对象,按随机数表法分为观察组(25例,采用八珍汤治疗)和对照组(25例,采用常规药物治疗).对比两组治疗前后的白细胞计数、治疗效果.结果:观察组治疗...     

HPV 16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗诱导CTL致CaSki细胞凋亡体外实验研究

目的:采用人乳头状瘤-16(HPV-16)E6E7重组腺病毒(pAd-E6E7)转染树突状细胞(Dendritic cell,DC),观察基因修饰的DC疫苗诱导细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic Tlymphocyte,CTL)致使CaSki细胞凋亡的效果。方法:将pAd-E6E7转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞制备DC疫苗,激光共聚焦显微镜观察转染的小鼠未成熟树突状细胞绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测转染前后小鼠树突状细胞表面标志物(CD40、CD86、MHCⅡ和CD11C)。DC疫苗诱导产生特异性细胞毒性T淋巴细胞,与CaSki细胞共培养后,采用DAPI、TUNEL及流式细胞术检测CaSki细胞凋亡情况。结果:pAd-E6E7成功转染体外培养的小鼠未成熟树突状细胞,体外转染效率约为40%～50%,成功制备了HPV16 E6E7基因修饰树突状细胞疫苗,诱导产生细胞毒性T淋巴细胞,经DAPI、TUNEL及流式细胞术检测证明CaSki出现凋亡。结论:以带有HPV16 E6E7基因的重组腺病毒载体转染DC制备基因修饰的DC疫苗,诱导CTL致使CaSki细胞出现凋亡。     

鸭MCHR2的基因克隆及蛋白表达鉴定

目的筛查能够稳定表达黑色素浓集激素受体2(MCHR2)基因的动物,为构建动物模型提供实验依据。方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜的鸭、Wista鼠、SD鼠、C3H10鼠、C57鼠、狗、羊、猪等大脑组织中提取总RNA,以此扩增MCHR2基因的全长cDNA编码区序列;利用Western blot检测鸭、犬和猪的大脑海马区及皮质区MCHR2蛋白的表达情况。结果通过RT-PCR获得鸭、犬、猪脑组织中的目的片段;通过Western blot验证了MCHR2蛋白在鸭脑组织中具有高表达。结论将鸭作为构建动物模型的对象,用于MCHR2基因的相关功能研究具有可行性。