孟鲁司特钠对ITP 模型小鼠T 淋巴细胞亚群及晚期氧化蛋白产物的影响

目的:探讨孟鲁司特钠对特发性血小板减少性紫癜(ITP)模型小鼠T 淋巴细胞亚群、细胞因子及晚期氧化蛋 白产物(AOPP)的水平,分析孟鲁司特钠治疗ITP 的机制。方法:将40 只ITP 模型小鼠随机分为对照组、模型组、孟鲁司特钠 低剂量组(3 mg/ kg)和孟鲁司特钠高剂量组(12 mg/ kg)。成功造模后第8 天开始,连续14 d 给药后,计算血小板数量(PLT)、 胸腺、脾脏指数,采用流式细胞仪检测外周血T 淋巴细胞亚群,酶联免疫法检测血清中IL-6、TNF鄄琢、AOPP 水平。结果:与空白 组小鼠比较,模型组小鼠的PLT、脾脏指数、CD8+ 、IL-6、TNF-α、AOPP 水平显著升高(P<0.05),CD3+ 、CD4+ 、CD4+ / CD8+ 水平显 著下降(P<0.05);与模型组比较,孟鲁司特钠低、高剂量组小鼠脾脏指数、CD8+ 、IL-6、TNF-α、AOPP 水平显著降低(P<0.05), CD3+ 、CD4+ 、CD4+ / CD8+水平显著上调(P<0.05)。结论:孟鲁司特钠能够通过调节免疫功能紊乱,消除AOPP 积累,降低IL鄄6、 TNF鄄琢水平,对ITP 起治疗作用。     

肌醇5'磷酸酶基因突变对K562细胞周期蛋白和Akt磷酸化的影响

目的 从分子水平探讨肌醇5'磷酸酶(SHIP)基因突变对人白血病细胞系K562细胞周期及其相关基因表达的影响.方法 应用携带野生型和突变型SHIP及绿色荧光蛋白的慢病毒及空载体慢病毒质粒转染K562细胞,通过流式细胞术检测K562/SHIP细胞转染效率、细胞增殖指数及细胞周期变化;MTT法检测细胞增殖活性改变,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测SHIP mRNA水平变化,Western blot检测各组K562细胞SHIP、细胞周期蛋白(cyclin)D1、p21WAF1/CIPI、P27KIP1蛋白表达水平及Akt磷酸化变化.结果 野生型SHIP基因能明显抑制K562细胞增殖,并产生明显的G0/G1期阻滞[G0/G1期细胞分别为(34.2±7.8)%和(0.7±8.3)%,P<0.01];但SHIP基因点突变并未影响K562细胞增殖及细胞周期改变[G0/G1期细胞分别为(33.4±4.2)%和(36.3±6.7)%,P>0.05].Western blot结果发现转染野生型SHIP基因后K562细胞Akt磷酸化和cyclin D1表达水平明显下降(P<0.01),p21WAF1/CIPI、p27KIP1表达增高,而突变型SHIP基因对Akt磷酸化水平和细胞周期蛋白表达几乎没有影响(P>0.05).结论 ①野生型SHIP基因通过下调K562细胞Akt磷酸化水平,进而抑制其下游cyclin D1表达,上调p21WAF1/CIPI和p27KIP1基因表达,导致细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制K562细胞增殖;②SHIP基因突变体(TTC→CTC,Phe→Leu)丧失了对K562细胞的增殖抑制作用,提示SHIP基因对K562细胞增殖的负调控作用有赖于其基因结构和功能正常.     

成人白血病中PTPRO基因表达的研究

目的通过检测成人白血病中受体型蛋白酪氨酸磷酸酶-O（PTPRO）基因的表达水平,研究其在白血病发病中的作用及临床意义。方法将入选患者分为急性白血病（AL）初治组、完全缓解组（CR组）、慢性粒细胞白血病组（CML组）和正常对照组（NC组）,Syber Green荧光定量PCR方法检测白血病和NC组骨髓单个核细胞（MNC）中PTPRO基因的表达。结果（AL）初治组PTPRO表达水平低于CR组（P=0．028）,更低于NC组（P〈0．01）;CML组低于CR组和NC组（P〈0．05）,与初治组比较差异无统计学意义（P=0．295）,初治组中AML与ALL表达水平差异无统计学意义（P=0．158）。结论PTPRO基因在成人白血病中表达水平明显降低,提示PTPRO基因在白血病的发生发展中可能具有一定作用。     

外源性肌醇5′磷酸酶对K562细胞增殖及凋亡的影响

目的 通过慢病毒载体介导外源性5'肌醇磷酸酶(SH2 domain contaihing inositol 5'-phosphatase,SHIP)基因转染K562细胞,探讨ship基因对K562细胞生长增殖的影响.方法 以白血病细胞株K562为研究对象,将携带ship基因的慢病毒感染K562细胞,FQ-PCR方法检测ship转录水平,Western blot方法检测转染后SHIP蛋白表达变化;比较ship基因表达前后细胞增殖、形态的变化.结果 FQ-PCR和Western blot结果显示,携带ship基因的慢病毒载体pReceiver-Lv31能高效转染K562细胞,阳性率(74.6±5.8)%;细胞生长曲线显示SHIP可显著抑制K562细胞生长,抑制率(35.0±3.1)%;集落形成实验显示SHIP能显著抑制K562细胞集落形成能力[K562/SHIP组集落形成率(36.7±7.1)%,K562/FIV组为(77.7±6.3)%,(P<0.05)];细胞形态观察发现凋亡增加,TUNEL法证实SHIP蛋白促进细胞凋亡.结论 外源性ship基因表达抑制白血病细胞系K562的增殖活性,并促进其凋亡.     

外源性SHIP基因表达抑制生长因子介导的K562细胞增殖及Akt磷酸化

【目的】探讨SHIP基因对IL-3诱导K562细胞系增殖的抑制作用,阐明跗,尸对K562细胞作用的机制。【方法】将慢病毒质粒pReceiver．Lv31-FIV和pReceiver．Lv31-SHIP转染K562细胞;转染细胞与IL-3共培养,Westernblot法检测K562细胞Akt磷酸化;观察转染野生型SHIP基因对K562细胞增殖的影响：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺失末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。【结果】重组慢病毒载体pReceiver．Lv31-FIV和pReceiver．Lv31-．SHIP转染K562细胞,GFP阳性率为74．6％。野生型s驯P基因阻断了IL-3对K562细胞的增殖作用,对照组（K562／FIV）细胞增殖抑制率（3．26％）明显低于转染s删P基因组细胞增殖抑制率（26．42％,P〈0．05）;集落形成实验显示SHIP能显著抑制K562细胞集落形成能力[IL-3作用组K562／SHIP细胞形成集落为60．3&#177;6．6,明显低于IL-3诱导的K562／FIV组（91．7&#177;4．2）]（P〈0．01）。细胞形态观察发现凋亡增加．Westernblot检测发现转染s删P基因组前凋亡酶pro．caspase-3降解增加,TUNEL法证实SHIP蛋白促进细胞凋亡。IL．3作用不同时间段（3h,6h,12h）,转染野生型SHIP组细胞增殖明显减弱,且Akt磷酸化水平均低于对照组（P〈0．05）。【结论】SHIP基因负调控生长因子（IL-3）介导的K562细胞增殖及其蛋白激酶活化。     

MMP-2和MMP-9在急性B淋巴细胞白血病中的表达及临床意义

本研究探讨急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患者骨髓细胞中基质金属蛋白酶-2和-9（MMP-2,MMP-9）的表达及临床意义。采用半定量RT-PCR方法检测初治、复发B-ALL患者和正常对照骨髓中单个核细胞MMP-2,MMP-9mRNA的表达。采用明胶酶谱检测B-ALL患者和正常对照骨髓单个核细胞孵育上清中MMP-2,MMP-9的酶活性。结果表明,初治、复发组B—ALL患者中MMP-2表达率明显高于正常对照组（P〈0．05）;MMP-9表达率明显低于正常对照组（P〈0．05）。髓外浸润组患者MMP-2和MMP-9表达率均明显高于无髓外浸润组（P〈0．05）,而MMP-2／MMP-9（＋）组髓外浸润发生率明显高于MMP-2／MMP-9（-）组。高危组B—ALL患者MMP-9表达率明显高于标危组,而两组间MMP-2表达率无显著性差异（P〉0．05）。结论：B-ALL患者白血病细胞可以产生MMP-2,MMP-9,可能参与了B-ALL的髓外浸润,MMP-9表达可能提示预后不良。     

慢性粒细胞性白血病中SHIP1基因的表达变化及机制探讨

目的观察SHIP1基因在慢性粒细胞性白血病(CML)患者中的表达变化,并通过特异性小干扰RNA(siRNA)封闭K562细胞株BCR-ABL基因的表达,探讨BCR-ABL基因表达对SHIP1基因的影响。方法应用RQ-PCR方法检测CML患者骨髓、正常人外周血白细胞及白血病细胞株K562中SHIP1基因表达的差异。另取K562细胞分为3组:空白对照组(不加任何干扰成分);非特异性siRNA处理组(加非特异性siRNA);特异性siRNA处理组(加入特异性siRNA封闭BCR/ABL融合基因),应用RQ-PCR及Western blot方法分别检测3组中BCR/ABL、SHIP1基因的mRNA及其相应蛋白P210(BCR/ABL编码)、P145(SHIP1基因编码)的表达,并比较各组中表达水平的变化。结果CML患者骨髓白细胞和K562细胞中SHIP1基因的表达明显低于正常人的外周血白细胞。特异性siRNA处理组中BCR-ABL基因mRNA和P210蛋白的表达水平明显下降,SHIP1基因mRNA和P145蛋白表达水平随BCR-ABL表达下降而增加;非特异性siRNA处理组与空白组相比无明显差异。结论CML患者SHIP1基因的表达低于正常人;特异性siRNA能够抑制BCR-ABL基因的表达;BCR-ABL基因能抑制SHIP1基因及其蛋白表达。     

三氧化二砷对淋巴瘤T2细胞株SHP-1基因的去甲基化作用

背景与目的:去甲基化作用可能是三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)对抗造血系统恶性肿瘤的另一种机制.本研究探讨As2O3对淋巴瘤细胞系T2细胞中抑癌基因酪氨酸磷酸酶(SH2-containinphosphatase-1,SHP-1)的去甲基化作用及对T2细胞生长增殖的生物学影响.方法:T2细胞以As2O3或5-氮杂胞苷(5-aza-2'-deoxyoytidine,5-AC)单独处理,或两药联合处理.采用甲基化特异性PCR、荧光定量PCR和Western检测As2O3处理前后SHP-1基因启动子过甲基化及其mRNA和蛋白表达状况、c-kit蛋白表达变化.MTT法检测细胞存活率.流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:As2O3能逆转SHP-1基因启动子甲基化,使T2细胞SHP-1 mRNA和蛋白重新表达,同时c-kit蛋白表达呈下降趋势;As2O3明显抑制T2细胞的增殖,随浓度增加及作用时间延长,其增殖抑制效应增加(P<0.05);2.5μmol/L浓度的As2O3作用T2细胞t,2,3d细胞增殖抑制率(9.8%,20.3%,47.5%)明显低于联合作用组(11.0%,36.7%.61.0%).As2O3可使T2细胞凋亡率增加,且随作用时间延长和浓度增加,凋亡细胞逐渐增多(P<0.05),联合作用组细胞凋亡率(1 d:17.3%;2 d:37.9%;3 d:67.9%)明显高于2.5 μmol/L As2O3单独作用组(6.1%,26.5%,50.9%).结论:As2O3能去除T2细胞中SHP-1基因甲基化,使其重新表达,并可能通过抑制c-kit受体及其信号转导路径的活化而抑制肿瘤细胞增殖,并诱导细胞凋亡.     

三氧化二砷对淋巴瘤细胞酪氨酸磷酸酶1基因的去甲基化作用

目的 探讨淋巴瘤细胞系T2和非霍奇金淋巴瘤(NHL)组织中酪氨酸磷酸酶1基因启动子区甲基化状态,三氧化二砷(As2O3)对T2细胞中SHP-1的去甲基化作用及对T2细胞生长增殖的生物学影响.方法 以不同浓度As2O3处理淋巴瘤细胞株T2,采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测T2细胞的生长变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡率的变化,采用实时定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和Western blot方法检测T2细胞SHP-1基因mRNA和蛋白表达及c-kit蛋白表达变化.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测T2细胞和32例NHL组织SHP-1基因启动子甲基化状态.结果 As2O3使T2细胞增殖受抑,凋亡增加,效应均具有时间和剂量依赖性.As2O3能逆转T2细胞SHP-1基因启动子甲基化,SHP-1基因恢复表达,同时c-kit蛋白磷酸化水平降低.SHP-1基因在对照组淋巴组织中呈完全性非甲基化状态,而在NHL组织中启动子甲基化出现率为87.5%(28/32).结论 在淋巴瘤细胞和NHL组织中,SHP-1基因启动子区域存在高度甲基化.As2O3能逆转T2细胞DNA异常甲基化,诱导SHP-1基因表达,并可能通过抑制c-kit受体及其信号传导路径的活化,抑制肿瘤细胞增殖.